重复测量资料在临床数据中非常普遍，常用重复测量的方差分析进行统计分析，但是经常面临的问题有：
①临床资料又常常含有缺失值，例如采用某新药治疗疾病，分别在治疗前，治疗后1月，治疗后3月测量Y指标，但由于病人依从性等原因，导致治疗3月后缺失几例数据。
②Y不满足正态性、方差齐性，且样本量不是很大。
怎么办？推荐分析神器之一：混合效应模型。本文结合文献，分享基于R语言实现混合效应分析的方法，主要采用nlme包中lme函数。
主要内容：
1.可视化不同组Hb随时间的变化趋势
2.时间作为分类变量，构建混合效应模型
3.时间作为连续变量，构建混合效应模型
4.模型1和模型2对比和选择
5.模型残差检验
文献分享
这篇文章是2021年发表在Neuroimage上，影响因子是5.8，作者观察了4个时间点，通过重复测量三个连续性指标，构建混合效应模型研究正常睡眠和睡眠不足对大脑微观结构的影响。《Sleep and sleep deprivation difffferentially alter white matter microstructure: A mixed model design utilising advanced diffffusion modelling》。
作者观察的时间点time分别是早上、晚上、第二天早上。观察的指标Y分别是INVF(神经突内体积分数),exMD(神经突外平均扩散率)和exRD(桡神经突外扩散性)。
上述折线图的横轴是时间点，纵轴是边际估计均值，每个时间点上加了误差线，这个图直观的看出两组人群各指标随时间增加的变化。
混合效应分析结果显示：
随着时间的增加，INVF 和 exRD 有显著的变化(p<0.05)，exMD没有显著变化。而exMD在TP1到TP3和TP1到TP4 的时间点中存在显著的交互作用，而INVF 和 exRD没有交互作用，可以参考原文翻译。
Results from the linear mixed model revealed significant main effects of time in INVF and exRD, but not exMD (see Table 2). Further, there were significant group × time interaction effects in exMD from TP1 to TP3 and from TP1 to TP4, but not INVF and exRD.
加载R包和数据
本案例数据来自外部数据集，共计22名患者，分为组1和组2，测量的指标是血红蛋白浓度Hb，测量的时间点分别是t1，t2，t3，t4。数据概况如下表：
数据结构：自变量X是分组变量，Y指标是4个时间点重复测量Hb浓度。
研究思路：1：Hb随t(时间)的变化趋势是什么？2：组1和组2相比，Hb随t的变化趋势是否不同？
1 加载数据
library(nlme); ##混合效应模型library(ggplot2)##作图library(emmeans)##边际估计dt <- read.csv('dt.csv')col = c("#006400","#ef1eef","purple") ##制作一个颜色变量注：首先需要将数据集转化为混合效应模型可分析的结构（俗称“宽数据”变为“长数据”)，这部分需要先处理数据，关于数据宽变长，后面有机会再给大家整下。这里加载进来的数据是已经处理好。
2 可视化Hb随时间的变化趋势
下面是图一的代码ggplot代码实现ggplot(data=dt, aes(time,Hb,color=group,group = as.factor(id)))+ geom_point(size=1,fill="White")+ geom_line( linetype=1, alpha=0.7, size=1)+ scale_colour_manual(values=col)+ scale_fill_manual(values=col)+ xlab("time")+ ylab("Hb")+ ylim(0,80)+ theme_classic()+ theme(legend.position="top")
结果解读：
图一是每个观察对象的Hb随时间的变化趋势，用两种颜色区别两组。图中每条线表示一个患者，纵坐标是Hb，横坐标是时间点。
图二是两组的Hb的估计边际均值随时间变化趋势。横坐标是时间点，纵坐标是估计边际均值，其中这个”均值”跟普通均值稍微有点差异，可以简单理解为均值。每个点上的误差线表示估计均值的标准误SE。
从以上两个图可以看出：Hb随时间呈线性上升的趋势，组2上升斜率低于组1，红色的线在绿色线下方。
3 时间作为分类变量，考察时间点和分组的交互效应
fit1<-lme(Hb~factor(time)*group,random=list(id=~1), method="ML",data=dt)summary(fit1)lme的参数说明：
formula：混合效应模型表达式，类似线性回归和二元逻辑回归，*表示分别考虑time，group，以及他们的交互作用。
random：设置随机效应，这里的随机效应是不同患者的随机截距效应。
method：模型参数的估计方法，有两种REML和ML。这里选择ML。
data：是数据集
4 模型1结果解读
模型1结果解释：
fit1返回的结果很多，
第一：最上面是模型的AIC,BIC和极大似然值；
第二：模型的随机效应，随机效应用方差表示；14.62是随机截距的误差项，6.5是残差
第三：模型的固定效应，也是我们最关注的核心分析结果。
第二列Value是回归系数，代表的是各组各时间点的均值。下面依次罗列。
Intercept: 表示组1的t1时间点的Hb的均值，是26.56；
factor(time)2，表示组1的 t2相比于t1，Hb的差值，是10.19；
factor(time)3，表示组1的 t3相比于t1，Hb的差值，是13.44；
factor(time)4，表示组1的 t4相比于t1，Hb的差值，是15.95；
group2， 表示t1时刻，组2相比于组1的Hb的差值 是-0.43；
factor(time)2:group2，交互项，表示组2的t2与t1两时点差与组1相比，差是-3.58。
factor(time)3:group2，交互项，表示组2的t3与t1两时点差与组1相比，差是-1.61。
factor(time)4:group2，交互项，表示组2的t4与t1两时点差与组1相比，差是-1.06。
根据以上的模型显示：随着时间的增加，Hb逐步增加，而组2比组1增长慢。根据模型的P值，可知，Hb随时间增加，其变化是显著的。而由交互检验P>0.05，显示组1和组2随时间的变化趋势基本一致，没有统计学差异，二者没有交互作用。
5 时间作为连续变量，考察时间点和分组的交互效应
fit2<-lme(Hb~time*factor(group),random=list(id=~1), method="ML",data=dt)summary(fit2)6 模型2的结果解读
模型2结果解读
第一：同上；
第二：同上；
第三：模型的固定效应，也是我们最关注的核心分析结果。
第二列 Value是回归系数：
Intercept: 表示组1随时间拟合直线的截距，表示组1的t1时间点Hb的均值，是23.68；
time，表示组1随时间拟合直线的斜率，表示组1的t2相比于t1，t3相比于t2的Hb的差值，是5.11；
factor(group)2，表示t1时刻，组2相比于组1的Hb的差值 是-1.68；
time:factor(group)2，交互项，表示组2与组1相比，两条拟合直线斜率的差是-0.12。
根据以上的模型显示：随时间增加，Hb变化是显著的。而由交互检验显示，P>0.05，显示组1和组2随时间的变化趋势基本一致，二者没有交互作用。
结果和模型1完全一致。
7 模型1和模型2对比和选择
两个模型似然比检验anova(fit1,fit2)
结果解释：
模型对比：
模型1和模型2的分析结果完全一致，而模型2更加简洁的给出了两组的Hb随t变化的速度和差别，不过模型2是假使Hb随t呈线性变化，关于选择是否恰当，可以采用似然比检验模型1和模型2，如上，P=0.3941,差异不显著，说明简化的模型2可以代替模型1，本次我们选择模型2作为最终的模型，也就意味这Hb随时间变化是线性的。
如果差异显著,P<0.05,则说明不能用用直线关系代替，可以考虑引入t的平方或者三次方拟合。
模型最终结果分析：
以上的分析已经回答出一开始的两个问题：
1.Hb随着时间增加而直线上升；
2.随着时间的增加，组1的Hb增长率是5.11个单位，组2的增长率是4.99(计算5.11-0.12)，但组1和组2增长的差别不显著(P=0.9282)，即二者增长率一致。
8 模型残差检验
对模型2进行残差检验Shapiro-Francia法检验sf.test(fit2$residuals[,"id"]) P=0.1128Kolmogorov-Smirnov法检验正态lillie.test(fit2$residuals[,"id"])P=0.3038可视化残差分布hist(fit2$residuals[,1], plot=T, prob=T, main="Histogram of residuals",xlab="Residuals")lines(density(fit2$residuals[,1],na.rm=TRUE))plot(fit2)
结果解释：
结果显示两种正态检验方法的P均大于0.05，说明模型的残差符合正态分布，图1是残差随机分布在直线两边，直方图显示的残差成对称的左右分布，结果均说明，模型残差符合正态分布，模型的构建是合理的。
