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kallisto 是2016年发布的一款无须比对的转录本定量工具，采用了名为pseudo-alignment的算法。传统的定量算法是根据reads的比对位置来确认其属于哪个转录本或者基因，而pseudo-alignment 算法不关系reads具体的比对位置，而是通过reads的kmer特征来判断其属于哪一条转录本，示意图如下
首先将每个转录本序列划分为kmer, 利用所有转录本的kmer序列构建de Bgujin Graph, 简称T-DBG，在这个图中，每个节点是一个kmer, 每条路径代表一个转录本， 由于转录本序列的冗余，实际上每个kmer对应多条路径，也就是对应多个转录本; 然后将测序的reads也划分为kmer, 并将其映射到T-DBG中。
最终定量时，将该reads的所有kmer对应的转录本取交集，就能够分析出reads可能属于哪些转录本序列。
软件的官网如下
官网有编译好的可执行文件，下载解压即可。代码如下
wget https://github.com/pachterlab/kallisto/releases/download/v0.44.0/kallisto_linux-v0.44.0.tar.gz
tar xzvf kallisto_linux-v0.44.0.tar.gz
解压之后，在文件夹下可以看到名为kallisto的可执行文件。从算法也可以看到，软件的运行需要两步，第一步对转录本的序列划分kmer, 构建T-DBG, 也称之为建索引；第二步对reads 定量。
1. 对转录本序列建立索引
kallisto支持读取gzip压缩的转录本序列，用法如下
kallisto index -k 31 -i hg19.idx hg19.refMrna.fa
只需要提供转录本的fasta格式的序列即可。-k参数指定kmer的长度，-i参数指定输出的索引的名字，注意kallisto建立的索引为一个文件。
2. 定量
kallisto 支持单端和双端数据的定量，双端数据用法如下
kallisto quant \
-i hg19.idx \
-o out_dir \
-t 20 \
R1.fastq.gz R2.fastq.gz
-i参数指定转录本的索引文件，-o参数指定输出结果的目录，-t参数指定线程数，kallisto支持gzip压缩的序列文件。
单端数据用法如下
kallisto quant \
-i hg19.idx \
-o output \
--single \
-l 180 \
-s 20 \
-t 20 \
reads.fastq.gz
对于单端数据而言，必须指定fragment长度的均值和方差，分别对应-l和-s参数。
在输出目录，会生成以下3个文件
├── abundance.h5
├── abundance.tsv
└── run_info.json
run_info.json 文件为JSON格式，保存了运行的命令和参数。
前缀为abundance 的文件，保存了转录本的定量信息。其中h5为HDF5格式的文件，当转录本数量较多时，相比纯文本，这种格式的文件大小会小很多；tsv为纯文本的文件，内容如下
target_id | length | eff_length | est_counts | tpm |
NR_103451 | 865 | 664.449 | 9 | 0.493026 |
NM_001243523 | 577 | 376.636 | 31 | 2.99591 |
NR_038931 | 2432 | 2231.4 | 36.9964 | 0.603491 |
对于HDF5的文件，可以采用如下命令转换为tsv格式的文件
kallisto h5dump -o out_dir abundance.h5
-o参数指定输出结果的目录，最终生成的文件名称为abundance.tsv。
·end·
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