摘要：抗菌药物耐药性（AMR）在病原细菌中的出现和扩散，正迅速成为公共卫生领域的危机。随着医药和畜牧业中对抗菌药物的滥用，对细菌产生了选择性压力，加速了耐药细菌的出现。同时，水平基因转移（HGT）在耐药基因的传播中扮演了一个关键角色，例如，它可以将AMR基因通过种间传播使致病细菌也携带AMR基因。抗菌药物除了本身的抑菌功能，还可能对微生物群体产生其它负面影响。本篇叙述的主要目的，是提供一个关于抗菌药物如何影响细菌中HGT的概述，重点是转化、转导和接合等过程，以及其他不太为人所知的HGT机制。普遍认为，接合过程在细菌中AMR传播中扮演着重要角色，因此，本综述主要聚焦于抗菌药物治疗如何影响这一过程。到目前为止，其他HGT机制在这方面被视为较不重要；然而，最新的研究发现显示，它们的作用可能比之前认为的更为重大。本综述也对抗菌药物治疗对这些过程的影响进行了最新的知识更新。总之，研究抗菌药物诱导的HGT机制是迫切需要的，因为这对开发新的策略来抗击AMR的传播至关重要。
正文：抗菌药物是一类至关重要的救命药物，它们能有效地杀灭或抑制细菌的生长。这类药物无疑已经拯救了成千上万被细菌感染的生命，并对经济发展产生了积极影响。然而，随着抗菌药物使用量的不断增加，抗菌药物耐药性（AMR）问题逐渐显现，其种类日益多样化且迅速传播。AMR的负面影响已在全球范围内显著体现：据估计，全球每年至少有70万人因具有AMR的细菌感染而死亡。预计到2050年，这一数字将上升至每年至少1000万人，经济损失可能高达100万亿美元。因此，理解细菌在临床和畜牧业环境中如何获得和传播耐药基因，对于应对日益严重的AMR挑战至关重要。AMR基因可以通过垂直传播（细菌分裂时的传播）或水平基因转移（HGT）的方式在细菌间传播。HGT允许细菌从其它微生物物种中获得新的遗传物质，这对细菌获得、积累和传播AMR基因起到了重要作用。越来越多的研究关注于抗菌药物如何可能进一步诱导HGT，进而影响AMR的增长。在面对抗菌药物诱导的强大选择压力时，耐药细菌种群可能会相对于敏感细菌种群获得竞争优势而增长。因此，通过HGT获得AMR基因的细菌，其适应能力可能迅速增强。虽然HGT传统上被视为与治疗无关的随机事件，但越来越多的证据显示，在某些情况下，抗菌药物治疗可能直接影响HGT机制。在这篇综述中，将探讨抗菌药物如何通过HGT机制影响细菌间AMR的传播。
水平基因转移（HGT）是将单链或双链DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程。HGT在细菌基因组的可塑性方面扮演着重要角色，对于进化和适应性至关重要，比如通过转移致病基因和抗菌药物耐药性（AMR）基因。
细菌之间的基因转移主要通过三种典型机制实现：含有自由DNA的转化、噬菌体介导的转导以及涉及质粒的接合转移。这些过程在许多综述中已被详细描述。简而言之，转化主要在肺炎链球菌和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性细菌中特别明显。细菌从环境中吸收外源DNA的短片段。
转化过程不需要细胞间接触，但细菌必须处于适当的生理状态以吸收外源DNA，并且同源重组通常限制了此过程涉及来自类似细菌的DNA。虽然诱发适合性的条件在不同细菌物种间有很大差异，但DNA吸收和整合的机制在多数革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌中是高度相似且保守的。接合是一种依赖于接触的、单向的DNA传输过程。接合所需的基因通常携带在如接合质粒和ICEs（也称为接合转座子）等MGEs上。这些机制包括四型分泌系统（T4SS）和DNA-processing complex（relaxosome）。通常，AMR基因被发现是这些MGEs的组成部分。接合被认为是与多种不同类别的抗菌药物相关的AMR基因传播的最重要过程。转导则是噬菌体介导的HGT，将DNA从供体细胞转移到受体细胞。在噬菌体裂解细菌时，生成的噬菌体颗粒可能偶尔包裹细菌DNA而不是噬菌体DNA，然后将这些DNA注射到新的细菌细胞中。
除了这些典型的HGT策略外，近年来还发现了其他基因转移机制，如基因转移因子（GTAs）、外膜囊泡（OMVs）和细胞间纳米管介导的转移。GTAs是由噬菌体衍生的序列，能够编码包裹DNA的噬菌体衣壳结构，并作为随机细菌基因组片段的转移载体。OMVs可以封装染色体和质粒的DNA片段及RNA，从而促进遗传物质的转移。OMVs可以吸收由自溶细胞释放的胞外DNA，或细菌可在OMVs脱落前将DNA打包进OMVs。已在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌等物种中证明，OMVs可以进行DNA的水平转移，也可作为物种间DNA转移的手段。纳米管是细菌间的一种主要交流方式，提供了一个网络用于交换细胞内和物种间的细胞分子。纳米管的功能类似于接合菌毛，但不通过像T4SS这样复杂的蛋白分泌装置工作。遗传性和非遗传性AMR都可以通过纳米管从邻近细胞获得。整合子则是一种天然的遗传组装平台，使宿主细胞能够捕获、整合和表达基因小片段，包括AMR基因。所有整合子的一个共同特征是一个整合酶基因（intI），它编码特异性酪氨酸重组酶，可以将基因小片段切除并整合到整合子中。这些小片段从一个细菌转移到另一个细菌的确切机制目前仍待进一步研究与理解。
抗菌药物对水平基因转移（HGT）的影响
转化
如前所述，细菌必须处于一种称为适应性的生理状态，转化才能发生。这种状态可以是自然发生的或由外界因素诱导。研究发现，氟喹诺酮类抗生素能诱导肺炎链球菌进入适应性状态。在军团菌属的肺炎杆菌中，也观察到氟喹诺酮类抗菌药物能诱导适应性基因的表达。对幽门螺旋杆菌的研究表明，当细菌暴露于环丙沙星的最低抑制浓度（MIC）时，转化频率增加了4-5倍。对肺炎链球菌的详细分析显示，抗菌药物治疗与适应性基因转录增加相关，可能是由于细菌的应激反应。最近的研究发现，亚致死剂量的阿米卡星和庆大霉素能显著诱导克雷伯菌属肺炎杆菌通过转化获得外源性pUC19 DNA。虽然相关研究数量不多，但结果表明抗生素暴露可以增加适应性基因的表达，进而提高转化率。目前尚不清楚这是否促进了AMR传播的增加。
转导
抗菌药物可能通过促进前噬菌体切除和宿主细胞裂解来影响转导。实验表明，环丙沙星的给药增强了从一株大肠杆菌到另一株的携带卡那霉素标记的Stx2前噬菌体的转导。环丙沙星介导的SOS响应导致了金黄色葡萄球菌菌株间病原性岛（SaPIs）的高频转移。β-内酰胺类药物治疗引发的SOS响应也触发了前噬菌体的切除和SaPIs的高频转移。抗菌药物治疗的小鼠肠道中，携带AMR基因的噬菌体数量比未接受治疗的小鼠更多。氟喹诺酮和卡巴霉素暴露增加了多重耐药沙门菌中预噬菌体基因abc2和kil的表达，并通过激活细菌SOS响应促进了转导。莫匹罗星和红霉素的低浓度暴露也诱导了临床MRSA之间的AMR基因转导。然而，抗菌药物暴露与噬菌体传播AMR的重要性仍需进一步研究。
其他较少研究的HGT机制
据我们所知，抗菌剂是否通过 OMV、GTA、纳米管机制或整合子诱导 HGT 的问题尚未得到系统研究，不过用抗菌剂能够诱导 GTA 和 OMV 的形成。例如，Brachyspira hyodysenteriae 的基因组中含有一种丝裂霉素 C 诱导的噬菌体样 GTA，名为 VSH-1。研究表明，丝裂霉素 C、卡巴多和甲硝唑处理可有效诱导这种基因，从而促进细菌菌株间的基因转移。亚抑制浓度的庆大霉素（8 毫克/升）和多粘菌素 B（4 毫克/升）可增加革兰氏阴性铜绿假单胞菌中 OMV 的产生，而低浓度的庆大霉素（0.1 毫克/升）和氯霉素（1 毫克/升）可显著影响巴氏不动杆菌的囊泡形成并增加其 OMV 的产生。此外，在万古霉素（256 毫克/升）和利奈唑烷（1 毫克/升）的 MIC 为 1=2% 的浓度下，暴露于亚抑制浓度的 b-内酰胺类抗菌素可刺激革兰氏阳性化脓性链球菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌产生 OMV。因此，暴露于诱导 SOS 反应的抗菌药物会诱导基因盒的切除、整合和表达率变化，从而增加携带整合子的群体中至少有一些细菌具有相关 AMR 基因高表达率的可能性。据报道，丝裂霉素 C、环丙沙星、三甲氧苄青霉素和氨苄青霉素诱导的 SOS 反应可显著增加 intI 的表达和基因盒切割的频率。据报道，丝裂霉素 C、环丙沙星、三甲氧苄青霉素和氨苄青霉素诱导的 SOS 反应可明显增加 intI 的表达和盒式切割频率。
接合
大量已发表的接合实验结果表明，抗菌剂可显著提高不同类型 MGEs 在体外和动物肠道中的转移频率。然而，解释这些实验的结果依然很困难。大多数研究都是在实验室条件下进行的。这些研究表明，不同的抗菌素对许多不同细菌中的不同接合元素具有广泛的影响。其中，有些研究使用的抗菌素与 MGEs 编码的抗药性不同。这类实验中转移频率的提高表明转移机制受到了真正的影响，因为结合子并不具有选择性优势。例如，Barr 等人首次报道，所用的全部五种 b-内酰胺类抗菌素（青霉素、甲氧西林、氨苄西林、萘夫西林和头孢拉定）的亚抑制浓度使四环素抗性质粒 tet-r 的转运频率从 100 倍提高到 1000 倍，这可能是由于金黄色葡萄球菌的细胞聚集作用增强所致。环丙沙星和丝裂霉素 C 增加了大肠杆菌和嗜热链球菌中氯霉素抗性 ICEs（SXT、ICESt1 和 ICESt3）的接合转移。在研究卡那霉素和氯霉素抗性质粒、从巴氏杆菌到大肠杆菌的 pLYL72 以及大肠杆菌菌株之间的 pAR060302 的接合转移时，在培养基中加入亚抑制浓度的四环素（1 和 10 mg/L）也显示了类似的刺激作用。与这些报道不同的是，最近发表的一篇论文显示，与 MGE 上抗性基因所属类别不同的抗菌剂对共轭效率的影响不到 5 倍。但大环内酯类和氯霉素类抗菌素的暴露除外，它们使抗 b-内酰胺类质粒 p2766-1 的转移效率提高了 31 倍。在该实验中，抗菌剂只在交配期存在 1 小时。短时间的存在是为了确保在交配期内只有可忽略不计的生长，从而能够区分抗菌剂对接合效率的影响和抗菌剂的选择性生长效应。
大多数研究都是使用与 MGEs 所编码的抗药性同类的抗菌剂进行的，因此很难就其对接合率本身的影响得出结论。例如，Valentine 等发现，用亚抑制浓度的四环素（1 毫克/升）预孵育乳杆菌供体细胞，可使带有六种不同四环素抗性元件的 pVAL-1 穿梭载体的转移率提高 20 至 10 000 倍。
尽管大量研究支持抗菌剂处理会影响 HGT 的观点，但也有相反的观点不支持这一观点，他们认为传统的接合实验设置无法区分抗菌剂对接合效率的影响和对选择动力学的影响。例如，一项研究表明，25 毫克/升头孢噻肟处理可使质粒 pUUH239.2 在不生长的大肠杆菌4 培养物中的接合转移增加 9 倍。同样，据报道，亚抑制浓度的四环素（1 毫克/升）和强力霉素（1 毫克/升）可显著增加 DM0133、RP4 和 pEC292 质粒在大肠杆菌菌株间的转移，而这是基于一项在整个实验过程（48 小时）中都存在接合作用的研究。此外，庆大霉素和万古霉素可使金黄色葡萄球菌中质粒 pWG613 的转移频率增加 10-20 倍 ，为支持庆大霉素的作用，该药物的亚 MIC（0.1 毫克/升）和磺胺甲噁唑（1 毫克/升）可显著增加大肠杆菌中磺胺甲噁唑抗性决定簇和质粒 pUCP24T 的转移频率。亚致死浓度的氨基糖苷类药物，如阿米卡星（0.5 毫克/升）和卡那霉素（0.5 毫克/升）也被证明能增加肺炎双球菌中质粒 pNDM-1 的共轭转移，1=2% MIC 的光谱霉素（64 毫克/升）能增加粪肠球菌中质粒 Tn916 的转移。
实验不仅关注单一药物的效果。联合疗法是一种潜在的治疗策略，其优点是两种抗菌素之间可能产生协同作用，且覆盖范围更广。例如，将庆大霉素（7 毫克/升）和氯霉素（5 毫克/升）暴露于双选择抗菌素的 MICs 中，发现会刺激 pCCMT61 在多个革兰氏阴性菌之间的接合转移，而单选择抗菌素则没有影响。同样，卡那霉素（14 毫克/升）和链霉素（8 毫克/升）这两种抗菌素的联合处理增强了共轭质粒 pRK2013、pSU2007 和 RP4 从大肠杆菌 DH5a 向大肠杆菌 HB101 的转移。
最近的一项研究表明，抗菌药物促进了接合的贡献被高估，作者计算出抗菌药物仅仅是作为选择力来调节接合动态。计算接合事件的方法也可能混淆结果。通常，我们在实验结束时使用种群密度之比（如转接子/供体（T/D）或转接子/接受体（T/R））来量化转移效率。然而，这个比率不仅由接合率决定，还由实验中不同细菌株的生长率决定。总的来说，接合实验的设置在抗菌药物的添加、交配时间、初始种群密度、供体/接受体比率、温度和测量时间方面存在很大的变化，这使得难以进行不同实验结果的比较。此外，如果供体、接受体和传输子细菌株之间的生长率差异很大，共轭率可能会被高估或低估。一些实验进行了体内相关性的评估，这些实验使用动物模型来模拟不同治疗方案的效果。这些实验都集中在肠道环境中，因为共轭转移在微生物组成员之间常常发生。例如，研究表明，亚抑制浓度的四环素（0.2 mg/L）治疗可将共轭转座子Tn1545从粪肠球菌传输到李斯特菌，使其在无菌小鼠肠道中的转移频率增加了10倍，而这并不是由于对传输子群体的选择效应造成的。体内结果与体外结果一致，通过使用荧光显微镜观察，我们在通过传统的选择性平板方法之外，能够更清晰地检测转移事件。这种创新方法可能会大大增加我们对体内共轭动态过程的了解。
最近的研究进行了在接合过程中没有抗菌药物的实验。供体细胞首先在头孢噻肟中培养，然后通过洗涤步骤去除抗菌药物，之后在没有抗菌药物的环境中进结合实验，以避免接合后的选择效应。此外，交配时间仅为30或60分钟，以减少交配期间生长的影响。在这些严格的条件下，我们发现治疗相关浓度的头孢噻肟刺激了IncI1质粒pTF2的转移，相较于未经预处理的供体细胞的接合实验，转移因子分别为8.4和6.6。在随后的实验中，同样发现头孢噻肟、氨苄西林和环丙沙星促进了不同大肠杆菌株中各种天然产生的ESBL质粒的增强共轭转移。另一项研究也得出了类似的结论，在这项研究中，供体细胞预先用环丙沙星或左氧氟沙星的亚最小抑制浓度处理，促进了质粒pUCP24T的共轭转移。
因此，尽管由于实验设置的不同而难以得出跨实验的一致结论，但这些精心控制的实验数据支持了抗菌药物暴露直接影响接合频率的观点。然而，需要指出的是，大多数研究仍然是在体外进行的，未来的研究需要包括体内实验，以便以类似的方式控制选择作用，并验证抗菌药物对接合转移的影响。
抗菌药物诱导增强接合转移的潜在机制
接合转移要求编码转运机制的基因在空间和时间上协调转录，而这些基因的表达水平往往与转录频率密切相关。有研究显示，亚抑制浓度的抗菌药物可以增加与转移相关基因的表达，增幅范围从2倍到80倍，这种增加在转录水平和蛋白质水平都观察到。目前，有两种可能的机制被提出来解释这可能导致抗菌药物治疗下接合频率增加的现象：(i) 抗菌药物治疗引发的全局细胞响应；(ii) 结合子的生长优势。
Beaber等的研究表明，抗菌药物诱导的水平的HGT（水平基因转移）是由SOS响应介导的。SOS响应受LexA（SOS抑制蛋白）和RecA（SOS诱导蛋白）的控制。RecA的共蛋白酶活性促进LexA蛋白的自我切割，导致SOS响应的激活。在大肠杆菌中，环丙沙星的暴露会激活SOS响应。根据目前的模型，这促使了霍乱弧菌衍生的ICE SXT中编码的抑制蛋白SetR的失活，从而刺激了其自我切割。这解除了对SXT转移激活因子SetC和SetD的抑制，增加了SXT转移所需基因的表达，从而导致大肠杆菌和霍乱弧菌中的转移频率增加。对ICEBs1和ICESt3的切除和转移也被显示受全局DNA损伤响应的调控。在其他研究中也描述了环丙沙星诱导的质粒共轭转移；然而，最近的研究表明，增加的质粒转移并不是直接由SOS响应引起的，因为共轭效率并未与SOS响应基因的上调相关。此外，这可能不是唯一的机制，因为最近的研究显示，头孢噻肟诱导的pTF2质粒在大肠杆菌中的增强共轭转移并未涉及SOS响应，因为在头孢噻肟治疗期间蛋白质组中没有SOS响应基因被上调。在2017年的Moller等人的研究中，头孢噻肟治疗诱导了质粒pTF2中IV型共轭机器基因的上调，并且增加的转移频率并未涉及SOS响应。该实验的设计方式是通过在没有抗菌药物的环境中进行接合，以避免共轭后的选择效应。这导致作者得出结论，一个不同于SOS响应的新机制负责增强接合。因此，实验被设计为阐明潜在机制，使用转录报告构建，其中将lacZ与主要接合基因traF融合。在该菌株中进行了随机转座子突变，选择头孢噻肟未能诱导报告基因的突变体。筛选出了七个染色体编码的基因，根据这种选择协议，它们是对pTF2共轭机器的抗菌药物诱导上调有贡献的候选基因。其中，转录反终止因子RfaH，在pTF2的tra启动子区域的ops元件上结合，被显示在头孢噻肟诱导共轭中起关键作用，直接或间接作用于同样在筛选过程中被识别的yhiN、waaP、waaQ、gnd和pgl基因。作者提出了大肠杆菌中抗菌药物诱导接合增加的可能模型；然而，仍需要进一步的实验来揭示这些参与途径的基因的确切作用。
另一个值得注意的机制是群体感应（QS），它是细菌之间通过信号分子进行“细胞间”交流的过程。信号分子包括大肠杆菌中的自感应素-2（AI-2）以及其他变形菌门细菌中的酰化高丝氨酸内酯（AHLs）。最近的研究发现，低浓度的庆大霉素抑制了铜绿假单胞菌中的QS并促进了接合。这个机制似乎是因为庆大霉素的暴露抑制了与产生QS AHL信号分子相关的两个基因lasI和rhlI的转录水平，并显著增强了pUCP24T质粒从大肠杆菌到铜绿假单胞菌的接合转移。然而，这一机制的确切细节仍需要进一步研究来明确。
结论和展望
在临床环境中，抗菌药物耐药基因的水平转移主要通过接合机制发生，但其他转移系统，如转化和转导，也是抗菌药物耐药基因传播的重要方式。目前，大多数关于抗菌药物治疗对水平基因转移（HGT）影响的研究都集中在接合转移过程上。这些研究涵盖了多种不同的抗菌药物、移动遗传元件（MGEs）、细菌菌株和耐药基因，用以验证抗生素诱导的接合转移。然而，这些研究的一个主要限制在于，它们未能在转移后期继续抗菌药物治疗，这使得无法将增加的接合转移与转移子的选择性生长优势区分开来。最近，通过精心设计的定量研究，这两个因素得以区分，得出结论，抗菌药物治疗可能导致转移机器的上调，并导致更多的转移事件发生。此外，这两项研究揭示，环丙沙星诱导了ESBL质粒pTF2以及庆大霉素耐药质粒pUCP24T的共轭转移，表明一种抗菌药物可能导致对其他抗菌药物耐药的基因转移。然而，这类研究目前仅在有限数量的细菌物种和抗菌药物上进行。
综合来看，当前的综述研究发现，在某些情况下，抗菌药物治疗可以直接影响移动遗传元件的转移机制。然而，我们仍需更深入地了解这些机制在体内的重要性。在确定其影响之前，我们建议这一知识可能对抗菌药物耐药基因的传播风险有潜在影响。此外，这些结果还表明需要进一步研究，以阐明抗菌药物治疗如何影响各种HGT机制。一旦我们了解了这些机制，这些知识可能被用来开发避免这种治疗效应的方法。
