Nature Communications | 北京大学叶敏/乔雪团队在豆科植物芹糖苷类成分的生物合成研究方面取得重要进展...

2023年10月20日，北京大学药学院叶敏/乔雪团队在国际著名期刊 Nature Communications 在线发表了题为“Insights into the missing apiosylation step in flavonoid apiosides biosynthesis of Leguminosae plants”的研究论文。该研究在豆科植物甘草中挖掘得到酚类芹糖转移酶GuApiGT。通过晶体结构分析、分子对接与动力学模拟、理论计算和突变实验探究了GuApiGT的芹糖供体选择性机制。进一步利用关键Motif挖掘到了豆科植物中的121条芹糖转移酶候选基因，并对其中4条进行了功能表征。最后在本氏烟草中重构了芹糖甘草苷类化合物的从头合成途径。

  芹糖是一种含有叔醇基团的支链戊糖。目前已报道约1200个植物来源的芹糖苷，其中黄酮类芹糖苷占比最大，且在植物生长调控中发挥类激素样作用。但是芹糖苷类成分的生物合成途径尚不清楚，芹糖转移酶的催化机制亦不明确；由于其结构特殊，化学合成芹糖基团步骤繁琐且不经济。因此挖掘可识别催化芹糖的糖基转移酶对芹糖苷类成分的研究与应用具有重要意义。

  豆科植物甘草具有补脾益气，祛痰止咳，调和诸药的功效，有“国老”之誉。叶敏课题组长期从事于中药甘草研究。课题组前期发现芹糖甘草苷具有明确的止咳活性，然而其生物合成途径关键的芹糖糖基化步骤一直未被阐明，因此本研究以甘草为研究对象，挖掘关键的芹糖转移酶。

•   甘草中芹糖转移酶GuApiGT的挖掘与功能表征

  通过化学成分分析，发现芹糖甘草苷等成分主要分布在甘草的根部，而皮部和地上部分不含该类成分。生物合成途径的分析表明，GuCHS、GuCHR为芹糖甘草苷及芹糖异甘草苷生物合成的共有关键步骤。因此作者将GuCHS、GuCHR作为bait，甘草根、皮部及地上部分转录组为数据库，进行共表达分析，最终4条基因被注释为糖基转移酶。通过异源表达，发现MSTRG.23171.4可以高效催化（异）甘草苷生成芹糖（异）甘草苷。作者将其命名为GuApiGT，这也是自然界鉴定的第一个酚类芹糖转移酶。

•      GuApiGT底物杂泛性

   底物杂泛性研究表明，GuApiGT可高效催化黄酮7-O-糖苷、4′-O-糖苷、5-O-糖苷、黄酮6-C-糖苷、氧杂蒽酮碳苷、香豆素糖苷及松脂素糖苷等37种酚类底物，发生芹糖糖基化反应，其中11个芹糖苷产物结构被准确鉴定。

•      GuApiGT的芹糖供体选择性机制研究

   有趣的是，GuApiGT特异性识别UDP-芹糖供体。为探究芹糖供体选择性机制，作者解析得到GuApiGT的晶体结构（分辨率2.2Å），是第一个芹糖转移酶晶体结构。通过结构比对分析，发现GuApiGT存在特殊的Motif：R³⁶⁸L³⁶⁹G³⁷⁰S³⁷¹D³⁷²H³⁷³，由R³⁶⁸L³⁶⁹G³⁷⁰S³⁷¹组成的柔性loop和α折叠起始端D³⁷²H³⁷³形成。由于丝氨酸S³⁷¹的存在，使得GuApiGT的PSPG box含有45个氨基酸，打破了植物UGT PSPG box含有44个氨基酸的常规认知。通过分子对接及动力学模拟，作者发现关键motif中D³⁷²、H³⁷³可以芹糖部分形成氢键相互作用。可能是由于S³⁷¹的存在，使整个motif区域柔性变强，长侧链残基R³⁶⁸可以摆动，与H³⁷³形成π-π/cation-π及氢键，进而与UDP部分形成氢键，从而发挥识别与稳定UDP-芹糖的作用。作者进一步利用MM/GBSA结合能计算、metadynamics和QM/MM计算阐明了GuApiGT发挥芹糖糖基化特异性的分子机制。

•   利用关键R³⁶⁸L³⁶⁹G³⁷⁰S³⁷¹D³⁷²H³⁷³ Motif对GuApiGT和Sb3GT1进行糖供体选择性改造

  为了进一步证明关键Motif在芹糖识别中的重要作用，作者通过双突变和三突变，实现了GuApiGT供体选择性的改造，如L369/H373Q双突变体和I136T/G370/H373Q三突变体分别可以高效催化木糖糖基化及葡萄糖糖基化反应。此外作者利用氢氘交换及蛋白热稳定性等研究进一步验证了其供体选择性的分子机制。

  作者将该规律应用于课题组前期鉴定的黄酮3-O-糖基转移酶Sb3GT1，并成功获得375S/Q377H等多个可以识别芹糖的突变体，进而解析了Sb3GT1野生型的晶体结构（分辨率1.9Å）和375S/Q377H突变体的晶体结构（分辨率1.43Å）。通过结构比较分析，发现S的引入使得关键Motif中loop柔性变得更强，这可能对芹糖的识别至关重要。

•   关键RLGSDH Motif是豆科植物芹糖转移酶的普遍规律

  为了挖掘更多的芹糖转移酶，作者利用在线转录组数据库进行了大规模非靶向生信分析，共发现来源于39种植物的121条芹糖转移酶候选基因，其PSPG box均含有45个氨基酸，特别有趣的是这些候选基因均来源于豆科植物。作者成功对预测的粉葛来源的PtApiGT、密花豆来源的SsApiGT、胀果甘草来源的GiApiGT和光果甘草来源的GgApiGT进行了异源表达，功能表征显示这些候选基因均有芹糖糖基化活性。以上结果表明关键的RLGSDH Motif（PSPG box含有45个氨基酸）很可能是豆科植物芹糖转移酶的普遍存在的规律。

•   利用本氏烟草全合成芹糖甘草苷及其类似物

  作者通过引入12条基因，在本氏烟草中重构了芹糖甘草苷及芹糖异甘草苷的从头合成途径。其分为黄酮母核模块（AtPAL、AtC4H、At4CL、AtCHS、GuCHR、GuCHI），糖供体模块（pgm、galU、CalS8、UAXS）及糖基转移酶模块（GuGT53、GuApiGT）。通过生物合成元件、菌株及OD₆₀₀等优化策略，进行7天的侵染，最终实现了本氏烟草全合成芹糖甘草苷5.46 mg/g及芹糖异甘草苷4.73 mg/g，产量与甘草药材含量相当。最后，作者通过改变黄酮模块的基因组合，实现了其它8种黄酮芹糖苷的全合成。

  综上，本研究在豆科植物甘草中挖掘得到芹糖转移酶GuApiGT。通过晶体结构分析、分子对接与动力学模拟、理论计算和突变实验，验证了关键R³⁶⁸L³⁶⁹G³⁷⁰S³⁷¹D³⁷²H³⁷³Motif对GuApiGT芹糖供体选择性的重要性。同时，挖掘到了豆科植物中的121条芹糖转移酶候选基因，并对其中4条进行了功能表征。最后在本氏烟草中重构了包括芹糖甘草苷在内的10种芹糖苷的从头合成途径，实现了全合成。

  北京大学药学院硕博连读研究生王昊天和博士后王子龙为论文的第一作者，北京大学药学院叶敏教授、乔雪研究员和瑞典乌普萨拉大学李俊豪博士为论文的通讯作者。

该研究工作得到了国家自然科学基金重大项目（81891010/81891011）、国家杰出青年科学基金（81725023）、博管会博新计划（BX20220022）、博士后面上（2023M730131）的资助。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-42393-1