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之前的文章中介绍了GSEA软件的使用和结果解读，但是有几点漏掉了，在本文中补充一下。首先是Leading Edge对应的3个统计量，示例如下
在富集结果的表格中，最后一列为LEADING EDGE, 在这一栏中，包含以下3个统计量
- tags
- list
- signal
对于一个基因集而言，定义其中对Enrichment score贡献最大的基因为核心基因，也称之为leading edge subset, 参考下图
对于Enrichment score为正数的基因集而言，其核心基因是峰值之前的基因，对于Enrichment score为负数的基因集而言，其核心基因是峰值之后的基因。
tags表示核心基因占该基因集基因总数的比例，而list表示核心基因占所有基因总数的比例，signal利用这两个指标计算得到，公式如下
N代表所有基因的数目，Nh代表该基因集下的基因总数。对于一个基因集而言，当核心基因的数目和该基因集下的基因总数相同，signal取值最大，当该基因集的基因数目和所有基因数目接近时，signal的取值接近于0。
GSEA软件提供了Enrichment Map Visualization功能，自动调用cytoscape软件展示基因集富集结果，生成的图片示意如下
在该网络图中，两个基因集的基因存在overlap,则用线条连线，overlap基因的比例越越高，连线越宽。这张图和clusterProfiler中的emapplot函数残生的图片是一样的。
对于转录组数据分析而言，我们通常会采用DESeq2等软件进行差异分析，在差异分析的结果中已经给出了计算好的foldchange值，转录组的差异分析是非常复杂的，涉及到非常多的算法，比如归一化方法的选择，差异检验的统计模型等等，采用大家认可的差异分析软件，其结果更加的可靠。
GSEA软件默认的输入是基因表达量矩阵和样本分组，然后内置的进行归一化，进行差异分析，计算singal2noise等统计量，其本质就是自己进行了差异分析，计算出类似foldchange的统计值，其归一化算法是否适用于我们输入的表达量矩阵，在计算基因的foldchange值时有没有考虑生物学重复本身的变化程度，这些都导致其计算出的foldchange值并不能满足我们的需求，更加有效的做法是采用专用的差异分析软件计算出的foldchange值来进行富集分析。
GSEA的开发者也考虑到这个问题，所以提供了Run GSEAPreranked工具，支持直接导入事先排序好的基因列表，对应文件的后缀为rnk, 内容示意如下
第一列为基因ID,第二列为对应的foldchange值, #开头的行为注释，会自动忽略。通过这个工具，我们可以用DESeq2等差异分析专用工具算出来的foldchange值来进行富集分析。
这个工具相比默认的GSEA分析流程，有一个缺陷，它无法选择permutation test type, 在默认的流程中，提供了phenotype和gene set两种参数供选择，默认值为phenotype, 而 GSEAPreranked工具只支持gene set。
phenotype适用于生物学重复数目大于7个的情况，而gene set试用于生物学重复小于7个的情况。为了保证结果的可靠性，官方推荐条件允许的情况下尽可能使用phenotype, 因为这个参数用来评估基因集富集的pvalue值，可以有效控制结果的假阳性率。
GSEA的核心是Enrichment score的计算，除了GSEA软件外，还有很多的工具也都支持这个算法，如果想要利用DESeq2等工具自定义计算处的基因排序列表进行富集分析，更推荐使用clusterProfiler等第三方工具。
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