1 植物DNA的甲基化修饰
DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，其调控机制和生物学功能是目前研究最为深入的。DNA甲基化是指DNA特定碱基在甲基转移酶的催化下，从甲基供体获得一个甲基集团的化学修饰。S-腺苷甲硫氨酸(S-adenyl methionine, SAM)是广泛存在于各类细胞中的甲基供体。近年来的研究显示，甲基化可以发生在胞嘧啶的C5位和N4位，分别形成5-甲基胞嘧啶(5 mC)和4-甲基胞嘧啶(4 mC);还可以发生在腺嘌呤N6位，形成N6-甲基腺嘌呤(6 mA)[3,4]。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在CpG岛中[5],而在植物中，胞嘧啶甲基化可以发生在CpG岛、CHH、CHG(H代表A, C或T)以及转录区域和基因主体上[6,7]。
DNA甲基化位点和调控机制繁多，现有研究已经鉴定到多种甲基转移酶参与该过程。哺乳动物有三种活跃的胞嘧啶DNA甲基转移酶，包括DNMT1, DNMT3A和DNMT3B[8]。在植物中，已经鉴定了MET1、CMT3和DRM2三种DNA甲基转移酶[9,10,11]。其中CMT3是植物中特有的DNA甲基转移酶，能够使异染色质区的CHG序列发生甲基化作用[9];MET1是哺乳动物甲基转移酶DNMT1的同源物，在DNA复制过程中识别单拷贝及重复序列的CG位点，使得该CG位点发生甲基化[10];DRM2则是在小分子RNA介导下发生重新甲基化作用，在CHH序列甲基化中作用最突出[11]。在玉米的研究中发现，DNA甲基转移酶在叶片生长过程中受到不同的调控，导致分裂区、过渡区、伸长区和成熟区之间存在不同的CG和CHG甲基化模式。其中，差异DNA甲基化主要发生在与染色质重塑、细胞周期进程和生长调控有关的基因上，表明DNA甲基化在玉米叶片生长中起着重要作用[12]。此外，有研究发现植物DNA甲基化在组织培养期间发生了很大的变化，拟南芥的芽再生需要生长素介导的WUS基因的表达，DNA甲基转移酶CMT3或MET1功能障碍可以使细胞分裂素直接诱导WUS的表达，而不需要在含生长素的培养基上预先孵育，从而加速了新芽的再生[13,14]。由此可见，DNA甲基化与细胞再生过程密切相关。
DNA甲基化可以被动失去或主动去除，DNA复制后如果DNA甲基转移酶活性低或缺少甲基供体会导致新合成的DNA链上DNA甲基化的丢失，这称为被动DNA去甲基化。而主动DNA去甲基化是指在去甲基化酶的作用下移去甲基基团来消除DNA甲基化。去甲基化酶可以将整个甲基化胞嘧啶碱基从DNA骨架上移除，随后通过碱基切除修复途径用未甲基化的胞嘧啶填充产生的单核苷酸缺口。在对哺乳动物主动去甲基化的研究中发现，双加氧酶TET(ten-eleven translocation)能将5 mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),并进一步氧化5hmC生成5-醛甲基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC),从而被TDG (thymine DNA glycosylase)从DNA上去除[15,16]。目前，在拟南芥中也发现了三种DNA去甲基化酶参与该过程，包括AtROS1、AtDML2和AtDML3[17,18,19,20]。AtROS1功能缺失导致多肽配体EPF2基因的启动子超甲基化，从而降低EPF2的表达，导致拟南芥过度生成气孔谱系细胞[21]。另外，OsROS1突变的水稻与野生型相比含有更多的蛋白质、矿物质、维生素、脂质和膳食纤维[22]。SlDML2在成熟番茄果实中的表达显著增加，介导了果实成熟期间的DNA去甲基化，SlDML2功能缺失突变体的果实不能正常成熟[23]。最近对叶片寿命的研究，报道了DNA去甲基化酶DML3可以参与调控拟南芥叶片衰老[24]。
对腺嘌呤甲基化的研究显示，在真核生物中已经鉴定了四种6 mA甲基转移酶，包括线虫中的DAMT-1[25]、人类中的N6AMT1[26]、四膜虫中的TAMT-1[27]以及纤毛虫中的MTA1c[28]。其中DAMT-1、TAMT-1和MTA1c都属于MT-A70家族，而MT-A70蛋白是否同样影响植物6 mA修饰需要进一步研究。另外通过系统发育分析发现植物中存在N6AMT1的同源蛋白，但其功能尚不明确[29]。已有研究鉴定的6 mA去甲基化酶包括线虫中的NMAD-1[25]、果蝇中的DMAD[30]以及哺乳动物中的ALKBH1[26]。最近在水稻中开展的研究，也报道了6 mA去甲基化酶ALKBH1,敲除ALKBH1会导致6 mA水平增加和水稻提早抽穗，表明水稻生殖发育需要6 mA。此外，在水稻中，6 mA位点与5 mC甲基化重叠，表明6 mA可能与其他表观遗传标记一起影响基因表达[31]。
2 植物RNA的甲基化修饰
随着RNA修饰检测和高通量测序技术的进步，研究人员发现多种RNA,包括mRNA、lncRNA和miRNA,都存在种类繁多的修饰，而且不同类型的RNA修饰的含量和功能也存在很大差异。迄今为止，在哺乳动物中已经发现和定位了多种修饰，包括N6-甲基腺嘌呤(m6A)[32,33],N1-甲基腺嘌呤(m1A)[34],5-甲基胞嘧啶(m5C)[35],5-羟甲基胞嘧啶(hm5C)[36],2'-氧-甲基-核糖核苷(Nm)[37],肌苷[38]、假尿苷(Ψ)[39]以及尿苷化[40]等。在植物中也已经报道存在多种RNA修饰，包括m6A、m1A、m5C、hm5C和尿苷化等[41,42,43],这些修饰在生物体生命活动中发挥重要作用[44]。
m6A是真核细胞mRNA最普遍存在也是研究最深入的表观修饰，在酵母[45]、哺乳动物[32,33]、拟南芥[43]和番茄[46]等多种真核生物中已有相关研究报道。在哺乳动物中，m6A几乎参与RNA代谢的所有方面，包括转录本稳定性[47]、翻译效率[48]、mRNA输出[49]、3′UTR加工[50]、多聚腺苷化[51]和mRNA剪接[52]等。在植物中，m6A参与调控了RNA稳定性、多聚腺苷化、3′UTR加工和mRNA翻译[43,53,54]。
m6A的修饰水平受甲基转移酶(writers)、去甲基化酶(erasers) 和结合蛋白(readers)的共同调控，这些调控蛋白的协同作用使得m6A修饰呈现动态变化，并发挥不同的生物学功能。研究发现，m6A修饰是由保守的多组分甲基转移酶复合物催化的。在哺乳动物中，m6A甲基转移酶复合物包含METTL3、METTL14、WTAP、VIRMA(KIAA1429),HAKAI,RBM15/ RBM15B以及ZC3H13[55]。m6A甲基转移酶复合体在哺乳动物和植物之间保守性较高。在拟南芥中，m6A甲基转移酶复合体包含MTA (METTL3的同源物)[56],MTB (METTL14的同源物)[57]、FIP37(WTAP的同源物)[43],KIAA1229/VIRLIZER(VIR)和HAKAI[57]。在拟南芥中，甲基转移酶组件(包括MTA、MTB、FIP37或VIR)的敲除或缺失会使胚胎发生停留在球形胚阶段，导致胚胎死亡[56,58,59]。MTA功能的丧失还会导致叶片皱缩，花序缩短以及顶端优势降低[60]。而FIP37功能的缺失会导致地上部顶端分生组织(SAM)的过度增殖[43]。在水稻中也发现甲基转移酶复合体的组分OsFIP或OsMTA2的敲除导致穗长、育性和有效籽粒数降低[61]。由此可见，m6A甲基转移酶复合体在植物发育过程中发挥重要作用。
m6A修饰是一个可逆的过程，甲基可以被去甲基化酶去除。在哺乳动物中，已经报道的m6A去甲基化酶有ALKBH家族的FTO[62]和ALKBH5[49];在植物基因组中，ALKBH家族也有许多成员，到目前为止发现的m6A去甲基化酶有AtALKBH9B[63]、AtALKBH10B[64]和SlALKBH2[46]。其中AtALKBH9B是第一个在植物中被鉴定的去甲基化酶，参与植物对virus感染的防御作用[63];AtALKBH10B的敲除导致了拟南芥开花延迟以及营养生长受抑制[64];SlALKBH2在番茄果实成熟中起重要作用[46]。然而系统发育分析表明，在植物中没有FTO的同源基因[29]。
结合蛋白可以在细胞核或者细胞质内与m6A修饰的RNA特异性结合，从而调控m6A修饰的RNA底物的选择性剪切、翻译速率和RNA降解等生物学过程。目前已知哺乳动物中的m6A结合蛋白主要是含有YTH结构域的蛋白家族、eIF3、HNRNP蛋白家族以及IGF2BP家族[47,65,66,67,68]。其中YTH结构域高度保守，含有该结构域的蛋白质在植物中也广泛存在，拟南芥中已鉴定出13个编码YTH蛋白的基因，其中有11个基因C末端区域高度保守，被称为ECTs[69]。最近有研究报道，植物中ECTs同样具有m6A结合蛋白的功能。例如ECT2在拟南芥内与m6A修饰的mRNA结合，影响毛状体的分枝，ECT2还可以调节RNA的3'UTR的加工以及增强mRNA的稳定性，在RNA新陈代谢中发挥双重作用[54]。此外，ECT3和ECT4也在拟南芥细胞质中结合m6A修饰的mRNA,与ECT2一同调控叶片形态发育[70] (图1)。
m5C是另一种重要的RNA修饰，近年来也受到广泛关注。研究发现，m5C在tRNA、rRNA和mRNA等各类RNA中均有分布，并参与各种生理活动[71]。在拟南芥中，m5C影响根发育关键基因的mRNA稳定性，甲基转移酶突变导致的m5C缺失会引起此类mRNA的衰退速率显著升高。该研究还发现，单核糖体(monosomes)处m5C丰度高，说明m5C还与mRNA翻译效率有关[41]。最近的研究还发现，m5C在植物中也可以调节RNA长距离运输[72]。拟南芥中TRM4B已被鉴定为催化m5C修饰的甲基转移酶[41,73]。研究发现，TRM4B功能丧失会导致主根变短和侧根减少[41]。此外，TRM4B缺失突变中tRNA稳定性降低[74]。尽管目前对m5C的功能有了初步探究，但是，其发挥功能的机制尚不明确。目前唯一已知的m5C结合蛋白是在人类细胞中发现的ALYREF,其可以通过结合mRNA上的m5C促进mRNA转运出核[75]。系统发育分析发现在植物基因组也编码多个ALYREF同源物[29],但这些蛋白是否具有m5C结合蛋白的功能尚不清楚。
植物中对RNA修饰的研究还发现，拟南芥mRNA中存在m1A[41]、hm5C[41]和尿苷化[42]修饰， 在rRNAs和tRNAs中存在肌苷和Nm修饰等[76,77]。最近，研究人员通过单核苷酸分辨率的Pseudo-seq, 首次在拟南芥中，不但鉴定到了mRNA发生假尿苷修饰的Ψ位点，同时检测到了其他非编码RNA中的Ψ位点[78],促进了对RNA修饰参与调控植物发育的理解。
3 表观遗传学检测方法
表观遗传修饰是一个动态且高度复杂的生物学过程，因此，对DNA/RNA修饰的检测需要能特异性、高灵敏度的检测分析工具。近几年，用于表观遗传修饰的分析方法已取得了很大进展，能够提供不同分辨率水平(总体、区域、位点特异)的表观遗传信息。
3.1 定量检测技术
RNA表观遗传修饰的定量测定中，常用的检测技术主要有二维薄层色谱法(two-dimensional cellulose thin-layer chromatography, 2 D-TLC)[79]、高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)[80]以及液相色谱-串联质谱法(coupling of liquid chromatography to mass spectrometry, LC-MS/MS)[43]。2 D-TLC需要首先将RNA酶解成单个核苷，根据甲基化核苷和非甲基化核苷在溶剂中的迁移率不同而进行分析，结合放射性同位素标记可以提高其检测灵敏性。HPLC也是基于核苷的极性不同进行分离，之后利用UV分光光度计对核苷的吸光度进行检测，以实现核苷酸修饰的定量检测。基于HPLC发展起来的LC-MS/MS技术，则使用质谱而非UV对分离得到的核苷进行检测，可以实现高灵敏度的定量分析。
与RNA修饰的检测类似，DNA甲基化也可以通过2 D-TLC、HPLC和LC-MS/MS检测。除此之外，检测DNA甲基化常用的方法还有高效毛细管电泳法(high-performance capillary electrophoresis, HPCE)[81],这是一种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术，在强电场下，DNA水解产物由于所带电荷、大小、结构以及疏水性等不同而相互分离，以实现对修饰核苷酸的定量。
3.2 高通量检测技术
高通量测序技术(high throughput sequencing)采用边合成边测序的策略，可以并行对数百万条DNA序列进行检测。全基因组6 mA研究中的最常用的检测方法是6 mA-IP-seq[82]。然而，抗体沉淀的DNA片段通常大于100 bp, 所以6 mA-IP-seq的整体分辨率较低。随后，研究人员结合CLIP技术与限制性内切酶DpnI、DpnII和CviAII发展了6 mA-CLIP-exo-seq[83]。这种方法所需样品量低，灵敏度高，可以实现6 mA单碱基分辨率的检测。但由于限制性内切酶识别位点具有明显的序列限制，因此无法检测识别序列之外的6 mA信息。在对5 mC的早期研究中，重亚硫酸盐测序(Bisulfite sequencing, BS-seq)被用于绘制5 mC的基因组分布图谱[84]。近年来，研究人员还开发了两种无重亚硫酸盐的5 mC鉴定方法，分别是TAPS(TET-assisted pyridine borane sequencing)[85]和EM-seq(Enzymatic Methyl-seq)[86]。这两种方法都先利用双加氧酶家族TET蛋白对5 mC特异性氧化，不同的是之后TAPS在吡啶硼烷作用下把羧基化的C转化成二氢尿嘧啶，二氢尿嘧啶在PCR和测序过程中会被识别成T;而EM-seq是在DNA脱氨酶APOBEC3A的作用下将未修饰的C脱氨为U,从而识别被甲基化的C。与BS-seq相比，这两种方法可以实现更高的绘图速率和更均匀的覆盖率，但无法有效区分5 mC和5hmC。为了解决这个问题，研究人员在BS-seq基础上发展了oxBS-seq[87]和TAB-seq[88]。oxBS-seq用KRuO4将5hmC氧化为5fC,而5 mC不会被氧化，在此基础上，采用BS-Seq方法分辨5 mC和5hmC绘制甲基化修饰图谱，分辨率可以达到单碱基水平。TAB-seq检测中，5hmC在β糖基转移酶作用下发生糖基化而免受TET酶氧化，5 mC和非甲基化胞嘧啶则被TET酶氧化，最后用BS-Seq绘制5hmC的分布和定位图谱。此外，Sun等建立了限制性内切酶AbaSI结合测序的方法(Aba-seq)[89],其原理是在用AbaSI消化之前使5hmC糖基化，然后通过接头连接进行测序。
高通量测序技术也被广泛用于对RNA修饰进行定量和定位检测。2012年，Dominissini D和Meyer KD分别开发了高通量测序与抗体免疫沉淀相结合的方法(m6A-seq或MeRIP)[32,33],在全转录组水平上对m6A修饰进行了检测，但二者分辨率最高为100 nt, 不能准确定位RNA转录本上的m6A位点。随后，光交联辅助m6A测序技术(photo-crosslinking-assisted m6A-seq, PA-m6A-seq)发展起来，它使用4-硫脲形成共价交联，显著提高了检测m6A在片段RNA上定位的分辨率[90]。近几年，研究人员发展了单碱基分辨率绘制m6A位点图谱的方法，包括利用高特异性的m6A抗体开发出的m6A单碱基分辨率交联共沉淀技术(MiCLIP)[91]和m6A交联免疫沉淀(m6A-CLIP)[50]。为了克服抗体潜在的非特异性结合等问题，研究者们进一步发展了不依赖抗体的技术，例如基于m6A结合结构域(YTH)与胞嘧啶脱氨酶(APOBEC1)融合蛋白实现的m6A测序方法DART-seq(deamination adjacent to RNA modification targets)[92]、利用对m6ACA序列甲基化敏感的RNA核酸内切酶MazF辅助的测序方法 (MAZTER-seq或m6A-REF-seq)[93,94],基于去甲基酶FTO蛋白的化学标记测序法m6A-SEAL(FTO-assisted m6A selective chemical labeling method)[95]以及引入烯丙基修饰的甲硫氨酸利用细胞代谢标记m6A位点的高通量测序方法(m6A-label-seq)[96]。这些技术的发展促进了在碱基层次上探究细胞内RNA甲基化的机理和功能。
RNA上其他类型修饰的检测方法和m6A的研究方法相似。例如，基于m6A-seq/MERIP-seq的程序，开发出了在转录组水平上检测m1A、m5C和hm5C修饰的方法，包括m1A-seq[34]、m1A-ID-seq[97]、m5C-RIP-seq[41]和hMeRIP-seq[36]。此外，研究人员还发展了多种化学手段代替抗体标记来进行区分和测序。重亚硫酸盐测序(BS-seq),也被用于检测非编码RNA的m5C位点[35,73]。例如，利用化合物CMCT (N-cyclohexyl-N'- (2-morpholinoethyl) carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)特异性反应结合高通量测序手段，可以对假尿苷修饰进行单碱基分辨率的全转录组高通量测序，包括Psi-seq[98]、Pseudo-seq[39]、ψ-seq[99]和CeU-seq[97]。最近，研究人员将CMCT标记和去甲基化酶处理相结合，开发了DM-Ψ-seq[100],能够以较低的测序深度检测tRNA组中的假尿苷修饰位点。
3.3 单细胞测序技术
越来越多的研究显示，不同组织或细胞系间表观遗传调控具有高度异质性和复杂性。传统的检测方法是在大量混合细胞中进行的，忽略了每个细胞的异质性信息。近些年，单细胞测序技术的迅速发展，实现了在个体细胞水平上探究表观遗传修饰，以及追踪细胞生理活动过程中表观遗传修饰的动态变化。
图1 拟南芥中的N6-甲基腺苷(m6A)修饰模式图。m6A甲基转移酶(writers)和去甲基化酶(erasers)导致mRNA中m6A修饰的动态模式。在拟南芥中m6A甲基转移酶复合体包括MTA,MTB,FIP37,VIR和HAKAI蛋白，而去甲基化酶包括 ALKBH9B和ALKBH10B。ECT2/3/4蛋白作为m6A结合蛋白(readers)与m6A位点特异性结合，介导特定功能。 下载原图
Fig.1 Illustration of N6-methyladenosine (m6A) modifications in Arabidopsis. m6A methyltransferases (writers) and demethylases (erasers) lead to the dynamic patterning of m6A modifications in mRNA. The methyltransferase complex consists of MTA, MTB, FIP37, VIR, HAKAI, and possibly other components, while the demethylases include ALKBH9B and ALKBH10B in Arabidopsis. The ECT2/3/4 proteins serve as m6A readers, which bind specifically to m6A sites and mediate specific functions.
图2 单分子实时测序原理。 下载原图
Fig.2 Principle of single-molecule, real-time DNA sequencing.
a. SMRT测序芯片上集成了大量纳米级尺寸的零模波导孔(zero-mode waveguides, ZMW)。待测DNA模板-聚合酶复合体被固定在纳米孔内；b. SMRT测序流程：(1) 四种核苷酸被不同光谱的荧光分子标记，可以扩散进出ZWM;(2) 核苷酸与模板-聚合酶复合物结合后， 发出对应的荧光信号，位于ZMW底部的检测器收集荧光信号； (3)核苷酸与DNA链形成磷酸二酯键后，其荧光基团被切除，并扩散离开检测区域；(4) 继续新一轮合成。
a. Each SMRT cell contains huge amount of zero-mode waveguides (ZMW) which are nanoscale small chambers. DNA template-polymerase complex is immobilized at the bottom of the ZMW;b. SMRT sequencing: (1) Four nucleotides labeled by fluorescent dyes with distinct emission spectrums may diffuse in and out of the ZMW; (2) When the dNTP is incorporated by the affixed template-polymerase complex, the fluorophore is excited and detected by certain device at the bottom of the ZMV; (3) Fluorescent dye is cleaved and diffuses out of the detection volume when the phosphodiester bond is created; (4) Continue a new round.
Guo等应用单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序(single-cell reduced-representation bisulfite sequencing, scRRBS) ,第一次实现了在单细胞水平对DNA的5 mC修饰进行检测[101]。该方法将PCR扩增之前的实验步骤整合到单管反应中完成，能以单碱基分辨率提供单个二倍体人类细胞内100万CpG位点的数字化甲基化信息。这种方法有其局限性，对许多重要调控区域(如增强子)的覆盖率较低。单细胞重亚硫酸盐测序(scBS-seq)是在亚硫酸盐处理后接头标记技术(PBAT)的基础上发展来的[102],是发展较为成熟的技术。然而，scBS-seq不能覆盖到高重复度全基因组，也不能追踪等位基因或链特异性甲基化差异。随后，Farlik等同样基于PBAT开发了单细胞全基因组重亚硫酸盐测序(single-cell whole-genome bisulfite sequencing, scWGBS)[103],用于绘制全基因组DNA甲基化图谱。其原理是在亚硫酸盐处理条件下，发生甲基化修饰的胞嘧啶被保留下来，未发生甲基化的胞嘧啶被转换成尿嘧啶，进而通过PCR转换成胸腺嘧啶。由此，通过测序可以判断CpG/CHG/CHH位点是否发生甲基化，此方法可以达到单碱基分辨率。此外，在已经建立的检测5hmC的技术中，TAB-seq和Aba-seq也可用于单细胞水平进行检测。
植物中表观遗传修饰的调控也有很高的细胞异质性，然而在植物中进行单细胞甲基化测序有很多挑战。一方面由于细胞壁的存在，很难获得完整且具有活性的单细胞原生质体。另一方面，对于高甲基化和高重复度的植物基因组来说，经重亚硫酸盐转化后的DNA片段很难被用于建库及测序。最近，研究人员开发了一种新的单细胞 DNA 甲基化测序技术BRIF-seq[104]。这项技术首先用未加标签的引物对DNA片段进行扩增，然后对这些随机扩增小片段进行单链连接、MDA扩增及基于Tn5建库。这些步骤保证了各种长度的转化片段都能进入文库用于测序。研究人员利用该方法发现玉米花粉中同一个四分体的四个小孢子之间甲基化水平相似，然而四分体之间DNA甲基化水平差异较大。此外，该方法还鉴定到细胞间甲基化修饰位点存在较大异质性。该方法不依赖DNA甲基化状态，能覆盖更多的高甲基化区段，因此理论上能被广泛应用于不同物种、不同组织和不同甲基化水平的细胞。
3.4 单分子测序技术
通量高、速度快、价格低的二代测序技术极大地促进了基因组学的发展，但也存在一定的弊端。例如，多轮PCR扩增会引入错误在一定程度上影响测序的准确率，而且测序读长较短，序列的高精度组装拼接难度很大。为了解决这些问题，第三代测序技术迅速发展，其标志性特点是单分子测序和测序读长长，同时具有通量高及成本低等优点。目前已经获得成功应用的第三代测序技术主要有单分子实时测序技术(single molecule real time, SMRT)和纳米孔单分子测序技术(single-molecule nanopore DNA sequencing)。这类方法不需要PCR扩增，可以在单分子水平进行边合成边测序，通过直接检测原始状态的样本来获得核酸和核酸修饰的信息[105]。
SMRT技术的基本原理是将DNA聚合酶固定于纳米级的小孔中，DNA模板被聚合酶捕获，四种带有不同荧光标记的核苷酸随机进入检测区域与聚合酶结合并释放荧光，与模板匹配的碱基生成化学键的时间长于非匹配碱基，根据收集到光的波长与停留时间可判断掺入的碱基类型，即可得到模板的序列数据(图2)。如果模板存在修饰，荧光标记的核苷酸与DNA聚合酶结合至释放荧光的时间会显著长于非修饰位点，并且核苷酸遇到不同类型修饰时具有不同的动力学特征，根据这些动力学特征信息，SMRT技术已经成功用于对DNA上的5 mC、5hmC和6 mA等修饰进行检测[87,106]。此外，研究人员通过用RNA逆转录酶代替DNA聚合酶，以RNA为模板反转录成cDNA,获得了RNA序列信息并检测到特定mRNA上的m6A修饰[107],从而验证了SMRT技术用于检测RNA序列和表观遗传修饰的可行性。
纳米孔单分子测序则是通过检测电信号，而不是光信号进行测序。由于四种碱基以及带有甲基化修饰的碱基带电性质不同，当单链DNA或者RNA通过特殊设计的纳米孔时，会产生不同的电流强度，通过检测电流的变化即可鉴定出所通过的碱基类型。因此，不需要对DNA或者RNA分子进行任何的前处理，直接进行纳米孔测序，可以快速读到单分子的甲基化信号。在DNA甲基化的检测中，5 mC与正常的胞嘧啶相比具有明显不同的分子特征，在通过纳米孔时可以被显著地区分出来[108]。其它的DNA甲基化修饰，如6 mA,也可以用纳米孔测序进行检测[109]。尽管与5 mC相比，6 mA与正常腺嘌呤在通过纳米孔时的差异较小，但仍然可以区分出单分子甲基化信号。研究中可以通过提高通量、增加重复率以弥补其准确性上的不足。最近的研究中，纳米孔测序也被应用于检测酵母中RNA的表观遗传修饰[110]。该研究使用的算法不是预测单个RNA分子的修饰，而是利用所有reads映射到特定位点的信息来确定给定位置是否被修改。目前，这种算法无法区分不同类型的RNA修饰(如m1A和m6A),因此还有很大的改进空间。
4 总结与展望
表观遗传修饰体系的可遗传性和可编程性，使得拥有相同基因组的个体和细胞，在不同发育阶段和外界条件下，可以呈现不尽相同的表观基因组和转录组，从而分化出复杂的形态和功能。近年来，高通量、低成本、高精度的测序与分析技术得以迅速发展。应用这些技术，研究人员已经鉴定到植物体内DNA和RNA上存在很多表观修饰。然而，仍有许多问题尚不明确，有待进一步研究。譬如，表观遗传修饰的动态、发生修饰的调控机制，以及其在植物生命活动中的具体功能。要深入阐明这些问题，需要不断发展和完善新的测序技术。如单细胞和单分子测序技术具有很好的应用前景，但目前的计算方法和技术还存在较高的假阳性，需要进一步改进和提升。迅速发展的表观遗传修饰检测技术，密切结合生理学、细胞生物学等多种技术与方法，将有助于系统研究DNA和RNA的表观遗传修饰特征与功能，解析生命活动的内在基本机理。
