1. 引物设计的基本原则是什么？

引物设计的下列原则供您参考：

  • 1) 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
  • 2) 引物长度一般在15-30碱基之间。
  • 3) 引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。
  • 4) 引物3′端要避开密码子的第3位。
  • 5) 引物3′端不能选择A，最好选择T。
  • 6) 碱基要随机分布。
  • 7) 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
  • 8) 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。
  • 9) 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
  • 10) 扩增产物的单链不能形成二级结构。
  • 11) 引物应具有特异性。

2. 常用引物设计软件有哪些？

常用的软件有Oligo 6和Primer Premier 5.0。引物设计软件是根据引物设计的指导意见设计而成。其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。引物设计软件的缺点是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。

金斯瑞为您提供以下引物设计相关软件：

  • 引物计算工具
  • 引物设计工具
  • 测序引物设计软件
  • Real-time PCR 引物设计软件

3. 文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？

通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用引物设计软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。

4. 如何计算引物的Tm值？

Tm值的概念：
DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，亦即DNA 变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为 DNA 的解链温度(Tm)。

金斯瑞采用以下方法计算Tm值：
长度为20mer及以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)。但这个公式只适用于14~20个碱基的引物，引物的TM值还与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲溶液的离子强度等有关。
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 0.41(% of GC) – 675/L + 81.5
注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量；% of GC = GC个数/引物总碱基数

5. 常见的引物修饰的有哪些?