背景：经颅磁刺激（TMS）是一种有效的治疗难治性抑郁症的治疗方法。TMS可能诱发与抑郁症相关的异常回路的功能连接改变。脑电图（EEG）“微观状态”是指假设代表大规模静息网络的地形图。典型的微状态最近被提出作为重度抑郁症（MDD）的标志物，但目前尚不清楚它们在经颅磁刺激后是否会改变或如何改变。方法：对49例MDD患者在基线时和每日经颅磁刺激6周后进行静息脑电图检测。采用极性不敏感的修正k-means聚类方法将脑电图分割为组成的微观状态。微观状态通过sLORETA进行定位。重复测量混合模型检验了被试内随时间的差异，t检验比较了TMS应答组和无应答组之间的微观状态特征。结果：从所有可用的脑电图数据中鉴定出6个微观状态（MS-1 - MS-6）。对TMS的临床反应与MS-2特征的增加以及MS-3指标的降低相关。无反应者在微状态中没有显示出明显的变化。在TMS治疗过程中，MS-2（增加）和MS-3（减少）的发生率和覆盖率的变化与症状的变化幅度相关。结论：本研究确定了与治疗性经颅磁刺激作用相关的脑电图微观状态。结果表明，脑电图可观察到静息网络的特异性改变。
1.简介
重复经颅磁刺激（rTMS或简称TMS）是治疗难治性重度抑郁症（MDD）的有效治疗方法，虽然其假定的作用机制尚不清楚，但TMS可调节抑郁症状背后的功能失调的整体网络。影像学研究表明，TMS激活特定功能网络的远端结点，进而引发与临床改善相关的持续连接性变化。除了全局效应外，TMS的重复脉冲还将刺激部位的皮层振荡与刺激频率同步。这些局部动态似乎也与TMS治疗的作用机制相关，因为个体的内源性峰值alpha频率与TMS治疗过程中应用的刺激频率越接近，治疗反应越好。
虽然经颅磁刺激治疗的疗效对于一个药物反应差的人群是有作用的，但只有大约50%的经颅磁刺激的患者能从6周的每日疗程中得到改善。以往的fMRI研究发下，个体静息态脑功能连接差异和抑郁类型差异有关，但是最近也有研究表示脑电图微状态也能鉴别抑郁亚型，描述了抑郁症的大规模网络动态改变。脑电图微观状态是半稳定的、瞬态电压地形，在静息状态的脑电图中经常反复出现。个体持续重复的微状态电压地形很可能是由功能连接的大脑区域重复共激活产生的，产生可以在头皮上检测到、一个持续重复的、暂时稳定的正负电压模式。微观状态持续大约80 ms，然后转移到另一个暂时稳定的模式。四种“典型”微观状态（A-D）几乎存在于几乎所有的被试中，这些状态被认为代表了大规模网络节点的同步活动。在疾病异常的研究中，微观状态提供了通过计算优化的方法从整个脑电图蒙太奇中捕获皮层活动的能力。虽然这四种典型原型通常出现在清醒的脑电图中，但微观状态可以从任何给定研究中的脑电图记录中聚类，而不需要对要选择的原型地图的数量进行先验假设；相反，拟合优度测量决定了每个数据集的最优地形数量。这种数据驱动的方法有利于对异常（即非典型）网络可能表现出临床症状的大脑疾病进行研究。本研究调查了在自然环境下接受标准6周经颅磁刺激治疗的MDD患者的微状态，以评估与经颅磁刺激相关的微状态变化及其治疗效果。预测：抑郁症状改善的患者的微观状态会有选择性地改变，说明TMS调节了以往研究证实的与MDD病理相关的大规模功能网络。
2.方法
2.1 被试
所有受试者均经临床医生根据DMS-5初步诊断为MDD，接受了一个标准疗程的经颅磁刺激治疗。期间，患者继续维持治疗前的药物和日常护理。在治疗前完成抑郁自评，之后每5个疗程后再测评一次（最终获得6次自评分数）。
2.2 临床评估结果
以30项抑郁症状学清单和自我报告量表（IDS-SR）的总分的变化（从治疗前基线到终点，以相对于基线的百分比表示）作为临床评估指标。分类临床“反应”定义为TMS-EEG后IDS-SR总评分中有50%的下降。对于相关和回归分析，IDS-SR随治疗的变化作为基线调整终点评分。抑郁改善情况可能是非线性的，因为更严重的抑郁症患者在终点表现出更大的百分比变化。为了建模目的，使用基线IDS-SR 对TMS后的IDS-SR评分基于基线进行了 six knot-restricted cubic spline回归。该回归方法可量化微观状态指标的显著变化和抗抑郁药物变化的相关性。用这种方法从终点测量中回归出基线评分，创建一个转换值以更严格地评估神经影像学变化与抗抑郁效果之间的关系。knot的选择是基于类似的先前的调查。
2.3 经颅磁刺激治疗疗程
患者在Neurostar (Neuronetics Inc., Malvern, PA) TMS设备上进行每日一次（工作日）经颅磁刺激治疗，使用8字线圈。采取左侧背外侧前额叶皮层（DLPFC）上以相对于左侧静息运动阈值120%强度的10 Hz或5 Hz的刺激方案，每次总共3000次脉冲。在耐受性较差的情况下，一些患者（n=4）在右侧DLPFC上单侧1 Hz刺激疗程（每次1800次脉冲）。一个典型的TMS治疗疗程包括超过6周的30个疗程，后6个额外的疗程，但根据临床反应和其他因素，少数患者在其治疗过程中接受了更少或更多的疗程。
2.4 脑电图记录和处理
ANT TMS-compatible EEG
system (Advanced Neuro Technology [ANT]; Enschede, the Netherlands)以2000 Hz或2048 Hz采样率记录64通道脑电图数据，参考电极为CPz。记录第一个疗程前和六周治疗后的脑电数据。在每个时间点，采集5 min的闭眼静息脑电图。离线预处理是在EEGLAB工具箱（v2020.0）中进行的。两个乳突通道不包含神经数据移除，分析留下的61个通道。重采样率为200Hz，滤波器截止频率为160 Hz，过渡带宽为80 Hz，1 Hz高通滤波，去除伪迹和噪声污染的片段和坏通道被拒绝，球形样条插值，平均重参考，并使用Zapline去除60 Hz的线噪声。然后AMICA 进行独立成分分析。使用DIPFIT3（v3.4）定位组件，通过将单个等效电流偶极子拟合到模板头模型上。神经成分通过两个标准进行识别：由ICLabel（v1.2.3）标记为“大脑”的成分，以及定位于大脑内的残差<为15%的成分，去除非神经的人工成分。在微状态分析之前，预处理的数据在30 Hz进行低通滤波。
2.5 微状态聚类
用EEGlab中的Microstate Analysis Toolbox (v1.0)进行聚类。来自治疗前和治疗后的记录同时被聚类，以确保识别共享的微状态原型，并提高选择与TMS相关的原型的机率。此外，跨试次和条件的聚类可以减少被试内的错误，并确保重测试的可靠性。聚类计算采用极性不敏感的改进kmeans算法。k范围从2设置到8，随机开始值，重复50次。原型图的数量由在k范围内的全局解释方差（GEV）和交叉验证标准的优化值决定。在选择了状态数及其对应的电压图后，原型图将回到研究样本的整个记录时间（n=49）。采用 a winner-take-all的方法，每个脑电图样本被标记为一个微观状态，将脑电图分割成组成的微观状态。最小微状态段持续时间设置为30 ms。从微观状态标签时间序列中提取了三个感兴趣的变量：发生率、覆盖率和持续时间。发生率是微观状态/秒出现的频率；覆盖率由给定微观状态占总记录的比例；持续时间是微观状态类出现时保持活动状态的时间均值，以毫秒为单位。
2.6 溯源分析
使用MATLAB的Brainstorm工具箱对微观状态进行溯源。提取个体脑电图数据，并通过微状态进行连接。这些连接的微观状态记录被导入到Brainstorm中。将标准的10-20电极位置与ICBM25模板头MRI共配准，并使用OpenMEEG计算边界元模型正向解。标准化低分辨率电磁断层扫描（sLORETA）将头皮信号定位到皮层受限（正常至皮层）源空间。对于每个被试微观状态源激活量求随时间变化的平均值，并z评分、校正和组平均。如fMRI结合分析，组平均图的激活阈值为超过95%。由于计算上的限制，源分析仅在TMS前的记录上进行.
2.7 统计分析
在MATLAB、SPSS 26（IBM）和RStudio中进行分析。采用Pearson相关性和独立样本t检验来评估相对于基线抑郁严重程度和人口统计学特征的微观状态特征。重复测量方差分析检验了应答者组和非应答者组之间的微观状态指标随时间的差异，利用时间作为受试者内部的因素，响应者状态作为受试者之间的因素。最终，评估了所有被试的时间主效应和应答者状态的交互效应，并调整了显著性阈值，以测试每个微观状态域内的3个特征，即alpha=0.017。当发现反应组效应的显著影响时，根据模型中包含的年龄和性别进行敏感性分析。配对学生t检验（双尾）比较了总体样本和每个治疗结果组的前和后微观状态的平均值。为了与其他微观状态分析中描述的方法相一致，配对t检验的p值对每个反应组内的微观状态检验数的bonferroni进行了校正（p=0.05/6=0.0083为显著性）。采用Cohen‘s d计算配对样本检验的效应量。为了评估微观状态的治疗预测特征，Pearson相关性检验了微观状态指标的变化与抑郁症严重程度的变化之间的关联（计算为从基线到治疗终点的IDS-SR %的变化）。微观状态与基线特征和IDS-SR变化值的相关性的显著性阈值由于其探索性而未被校正。敏感性分析将年龄和性别作为协变量纳入统计模型。
3.结果
3.1 临床评估指标
患者（n=49）的人口统计学特征和临床病史见表1。在脑电图后评估的抑郁结果被用来作为两个记录阶段之间的临床变化的准确测量。在TMS治疗过程中，患者的抑郁症状显著减轻（IDS-SR均值± SD变化：23.1 ± 15，t=-10.8，p < 0.0001，d=1.6），与前期试验预期一致。在脑电图数据采集时，21/49（43%）符合经颅磁刺激分类反应的标准。有反应者和无反应者在任何临床特征基线上没有显著差异。
3.2 微观状态分析
从聚类的175个记录中鉴定出6个微观状态（图1）。175份记录包括前tms（n=110）和TMS后（n=65）阶段的脑电图数据，包含98例MDD患者。在65例有治疗后记录的患者中，有61例有相应的预处理记录。61个匹配的TMS前和后的记录包括52个独特的受试者，因为一些受试者接受了多个TMS治疗疗程。其中，最近TMS治疗过程的脑电图被用于正式分析与临床反应相关的微观状态变化。在目前的分析时，3例患者有不完整的临床结果，并从数据集中删除，剩下49例样本用于与TMS相关的微观状态变化的正式分析。这6个微观状态解释了76.5%的全局方差，并且在所有记录中的交叉验证得分为0.3。单个微观状态（MS1-MS6）的GEVs分别为0.31、0.19、0.095、0.093、0.064、0.051。正如预期的那样，这四种常见的微观状态似乎出现在这个集合中。MS-1对应于典型的C，MS-3到D，MS-4到B，和MS-5到 A. MS-2似乎同样是一个正则状态的导数 C. 我们将这种视觉相似性作为与之前的相关的微观状态调查进行比较的基础（补充图2）。
图1 微观状态的地形、表示法和研究方案。A) 6集群原型微状态电压图。B）来自一个受试者的代表性样本通过脑电图微状态分割转换为其全局场电位（GFP）。K-means聚类利用了GFP峰值处的脑电图信号。C）分析流程图。微状态识别分析聚集了所有可用的记录，随后对一个具有完整记录和临床结果的患者子集进行了正式分析。源定位仅使用了预处理记录。
3.3 在基线时微状态与基线特征的关系
治疗前抑郁的严重程度与MS-1覆盖率（r=0.34，p=0.02）和发生率（r=0.33，p=0.02）相关，与其他微观状态指标（覆盖率、发生率、持续时间）与自评抑郁评分不相关。年龄和性别与基线时的任何微观状态指标都没有显著相关性。
3.4 与经颅磁刺激治疗相关的微观状态变化
重复测量混合模型的结果显示，时间主效应在MS-2和MS-3上显著，表现为MS-2增加和MS-3减少。配对t检验tms前和tms后的变化时，对多重比较进行了严格的校正，合并样本（n=49）的平均变化均未达到显著性阈值（p<0.008）。
图2 TMS疗程后的分类微观状态变化。A）发生率和B）MS-1 - 6的覆盖率。所有被试（上行）、有反应者（中间行）、无反应者（下行）。红色的p值符合bonferroni校正后的显著性阈值（p < 0.0083）；左边显示未校正后的p值，右边显示校正后的p*值。红线为平均值，红条表示均值的标准误差，蓝条表示标准差。
3.5 与TMS治疗反应相关的微观状态变化
评估各反应组内（50%改善IDS-SR的反应者；图2a和b）的微观状态变化。重复测量模型显示应答与否对MS-2的发生变化有显著影响（F（1,47）=6.38，p=0.015，pbonferroni=0.045）；当年龄和性别作为协变量时，这一发现仍然具有显著性。TMS反应者(n = 21) 在MS-2的发生率上和覆盖率上显著增加，持续时间上无显著变化；但无响应组在MS-2上都没有显著变化。对于MS-3，重复测量模型显示了反应者状态对发生率、持续时间和覆盖率都有显著作用；敏感性分析发现p值随年龄和性别保持不变或进一步降低。配对t检验显示，在应答者中，MS-3发生率和覆盖率下降，但是持续时间在反应者中无显著变化。无响应组在MS-3的特征上都无显著差异。事后检验发现MS-2的特征增加趋势与MS-3特征减少呈显著相关，代表存在相互作用。此外，应答者在MS-6的持续时间上前后有减少，但是无响应者没有变化。但这种应答者交互作用在重复测量模型中没有达到显著性（F（1,47）=3.12，p=0.084 pbonferroni==0.24）。其他特征持续时间显著的变化也没有观察到。微观状态1、4和5在TMS治疗过程中，无论是有反应组和无反应组，均无显著变化。
在观察了MS-2和MS- 3的应答者特异性变化后，评估微观状态变化与抑郁症状改善程度之间的关系，如图3所示。通过每个微观状态指标（发生率、覆盖率、持续时间）的时间点之间的变化与症状变化的相关性检验（基线校正后的IDS-SR终点得分，其中更多的负值代表更大程度地抑郁症状减轻）发现，TMS过程中症状改善与MS-2发生率（图3a）和覆盖率（图3b）的增加相关，与MS-3的发生率以及覆盖率下降相关。
图3 症状与微观状态变化的相关性。MS-2发生率（a）和覆盖率（b）的增加与抑郁症状的改善显著相关。相反，MS-3发生率（c）和覆盖率（d）的降低与症状改善相关
3.6 被调制的微状态网络的溯源位置
MS-2在额/颞极、吻侧前扣带皮层、眶额叶皮层和前岛叶激活最强烈。相反，MS-3似乎代表了后扣带区、运动/运动前区和顶叶的活动。微观状态1、3、4和5，似乎与它们之前对类似的规范微观状态的定位非常相似。
图4 MS2和MS3的溯源（MS 2 (a)，MS 3 (b)的sLORETA平均激活量）
4.讨论
本研究确定了随着时间的推移占主导地位的微状态网络，即治疗前和治疗后的静息脑电图数据，然后评估MDD患者在标准6周自然TMS治疗后这些微状态的变化。作为对TMS治疗反应的功能，多个微观状态的差异变化；两种特定的微观状态（MS-2和MS-3）在应答者中显著且相互变化。和其他研究一样，基线微状态和治疗结果并未发现关联。然而，在一个标准的TMS疗程后，那些更好改善的患者显示出MS-2发生显著增加，而MS-3发生显著减少。相关性分析表明微观状态2和微观状态3的变化幅度与临床改善的程度显著相关。
微观状态被认为是全局网络的瞬态激活。典型的微观状态C，对应于本文的微观状态2，在背侧前扣带皮层（ACC）、额下皮质和右侧岛叶有BOLD激活。这些区域与积极的情感“奖赏”回路包括眶额叶皮层、前、下前额皮层和前扣带回重叠。可推测，在TMS应答者中，这种奖励网络可能被激活得更频繁、时间也更长，这可能反映了快感缺乏症改善的潜在变化。微观状态3对应于典型的微观状态D，它们都激活了背侧和腹侧的额叶和顶叶皮质区域，属于注意和认知控制网络。TMS已被证明可以规范化默认模式网络（DMN）的超连通性。在TMS应答者中，MS-2的增加和MS-3存在减少可能同样反映了这种DMN的重新校准。这些神经调节诱导的微观状态变化可能暗示了一种共同的目的性抗抑郁机制。
本研究没有一个非抑郁的对照组样本进行横断面比较，但其他[11]在比较抑郁个体和对照组时发现了显著的微观状态组差异，抑郁的严重程度和某些微观状态特征之间存在显著的线性关系。下一步应调查这些微观状态变化在治疗过程中的进展，以了解它们是如何演变的。如果微状态变化可以检测到，那么也许脑电图微状态分析可以提供临床病人个体化治疗。
5.方法问题
1）微观状态分割作为一种过于简单的脑电图动力学度量而受到批评。“winner-take-all”的标签排除了其他可能与临床症状相关成分。在其GEV（76.5%）和聚类方法的约束条件下，生成的结果解释了大脑活动的大部分方差。
2）数据预处理导致的误差。由于记录的数量和微观状态分析的性质，我们使用了大量自动化的清洗方法，具有严格的伪影抑制，但代价可能是消除真正的神经信号。
3） sLORETA定位受到逆解的低空间分辨率和对所有受试者的使用模板MRI的限制。
4）微观状态指标的变化与抑郁评分的变化之间的相关性检验的显著性阈值未被校正。
5）由于覆盖率度量同时依赖于持续时间和发生情况，微观状态覆盖率变化的发现可能只是发生因素的产物。需要更多的工作来评估覆盖率是否是微观状态的一个重要或有意义的独立度量。
6）本研究大多数患者在经颅磁刺激的过程中继续服用多种精神药物，包括抗抑郁药物。虽然尚未进行专门的研究，但精神药物的使用可能会影响与特定模式相关的微观状态。同时使用药物、当前发作时间长短和运动阈值没有被评估为影响微观状态变化的可能协变量，未来的工作应该调查这些潜在的影响。
