水稻基因型鉴定全套流程
在做正向遗传学的过程中，我们常常会看到我们关注的表型，例如水稻分蘖角分蘖数等，同一个家系里面表型有很大差异时，我们往往会去关注其植株的基因型，我们会取极端表型的样品去全基因组二代测序，同过QTL-seq等数据分析，得到我们目的突变位点区域，当然当你开始做基因型鉴定时，往往已经有了大致的目的基因区间，在几号染色体上的某个具体位置附近，我们会在SNP，p值显著峰值附近设计引物，看群体有无多态性，若有则会开始今天说讲的内容。
水稻叶片DNA小样粗提
我们分析了目前市面上很多中提取DNA的方法例如，CTAB法，TPS法，水浴提取等等，其中利弊参半，因为我自己的实验进度是从早上开始从苗子上取样——到DNA提取——做pcr——聚丙烯酰胺凝胶电泳——读取数据所以对时间的把握非常之重要，如果操作得当以目前实验室条件可以达到2人每天八百个样品的量（保守估计）。之前的实验方法要么费时，要么费力，我们所用的这个方法会大大减少操作时长，不需要过夜干燥，不需要加水稀释，现提现用，唯一缺点是保存时间不能超过一星期，不过对于当天提当天看结果，缺点可以忽略。
实验流程
DNA提取
需要工具：
剪刀，镊子，钢珠(5.5mm直径)，2ml离心管，目前实验室农科大楼5060的打样机，
样品与试剂：
我们一般使用96孔板种植苗子(普通自来水)，种植时间不宜太长，基因型鉴定出来后立马移栽到大田。试剂：我们在实验室使用时发现不稀释效果也十分理想，故可以看情况来操作
DNA提取流程
1）先将96孔板上的苗子补齐，因为对因的是96孔PCR
2）用剪刀和镊子来取样，剪下一厘米左右的叶子放入试管中即可，提前摆好96孔板，和2毫升离心管，将样品按顺序添加进管内，做好标记，避免混杂，然后每个管子放一颗钢珠，并加入150ul粗提液，钢珠，叶片样品，与粗提液放入管中的顺序不固定。放好后，做好标记装入打样机打样80s,频率1500（时间不固定，多一点少一点影响不大）。（目前实验室没有96深孔打样机，有的其实更方便）
3）打完样品后得到的混合液即可直接取样做模板直接做PCR反应
PCR体系与流程
- 10ul taq酶体系（使用的是诺维赞公司的酶）具体参考说明书
- 程序：95°C X 3min +35*(95°C X 15s +58°C X30s +72°C X30s)+72°C X 5min +16°C X 2min (程序的变动依据来自目的产物的片段大小与所用引物的TM值。)
聚丙烯酰胺凝胶电泳
- 我们所用的聚丙烯酰胺凝胶电泳参考分子克隆实验手册，需要啰嗦的是我们的凝胶电泳一板上是可以跑多道的，一道可以点样96个，（自己的引物有跑过10道）所以对引物的选择还是比较重要的，做精细定位动不动就是上万的基因型需要你去鉴定，好的引物会大大缩小你的工作量。我一般设计的引物扩增目的条带大小为100~150bp(indel =5 ~10bp),当然条带在凝胶里面的电泳速度是可以通过速度公式计算出来的（后面会分享）,所以每条带间隔时间完全可以估摸出来，最怕的是你扩出来的产物有附带而且拖的很长，那就是引物的问题了，所以如过你一天只做800个样品，跑两对引物，则只需要做两板胶即可。
下图是我最近所做实验图，可做参考
