文献名：Proteomic analysis reveals that Topoisomerase 2A is associated with defective sperm head morphology
作者：Jacob Netherton1, Rachel A. Ogle1, Louise Hetherington1, Ana Izabel Silva Balbin Villaverde2, Hubert Hondermarck3, Mark A. Baker
期刊名：Molecular & Cellular Proteomics
发表时间：2019 年 12月17日
单位：澳洲纽卡斯尔大学
样本：人类精子
技术：SWATH(Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra)
一、 概述
男性不孕症，或低生育能力，通常是通过观察精子的产生总量、细胞的活动力和整体形态来诊断的。由于精子形态评估具有较高的主观性，往往导致一些不必要的辅助受孕。因此本文通过基于LC-MS/MS的蛋白质组学分析，比较了高质量和低质量精子的核提取物。所得结果显示，特定蛋白质在低质量和高质量精子细胞中存在着显著差异。此外，本文还证明在精子头部存在的拓扑异构酶2A与不良的头部形态高度相关，发现拓扑异构酶2A可以用于在临床实践中确认男性不育的潜在新生物标记。
二、 研究背景
男性不育的主要问题之一是实际诊断。虽然对精子总数和精子活力的测量在世界范围内是一致的(现在通常用计算机测量)，但是对精子形态的分析存在明显的问题。根据《世界卫生组织手册》(1992年)，精子可能有多种形态异常，包括头部、尾部和/或中段的缺陷，或者细胞可能有多余的残留细胞质。尽管精子形态是由特定的标准来指导的，实验室内部和实验室之间的差异仍然普遍存在。有报告显示，差异超过12%。事实上，在1391对接受辅助受孕的夫妇中，包括男性和女性不孕不育的案例，45.6%最终是自然受孕的。这表明许多夫妇被误诊，因此迫切需要更好的生育预后指标，尤其是关于男性生育潜力的指标，以避免对患者进行过度治疗。
三、 实验设计
四、 研究成果
1、 精核的分离、纯度和生化特性
使用不连续的Percoll密度梯度（30%、60%、100%）处理精子样本，分离获得高质量和低质量精子。如图1A所示，与处于100/60%渗透界面处的精子相比，位于管底的精子具有更高的密度。大多数(>90%)的低密度细胞（低质量精子）具有明显差的形态和运动能力，包括非晶态头部（图1B上，黑色箭头）；相反，高密度的细胞（高质量精子）富含形态正常、有活力和高繁殖力的精子（图1B下，白色箭头）。
如图1C，采用微分干涉(DIC)观察法对来自高质量或低质量精子的400多个细胞核进行计数，结果表明没有证据显示尾巴或中段断裂，并且在细胞核上没有明显的差异。此外，目前还没有圆形细胞污染，这表明细胞核是高纯度的。
图1. 用Percoll密度梯度法分离高、低质量精子
2、 低质量馏分中染色质压实度的差异
高/低质量精子经Percoll分离后，用SNS/EDTA处理、DAPI染色，结果显示一些来自低质量精子的染色质快速解凝或增大(图2A，白色箭头)。为了量化这一点，使用图像J来测量处理后两个种群的细胞核面积。在每种情况下，低质量细胞的DAPI染色区域显著高于高质量细胞(图2B)。这些数据表明，尽管未观察到核形态的明显差异，但来自低质量精子的染色质比来自高质量细胞的染色质更容易受到SDS-EDTA的影响，因此来自低质量精子的染色质可能不那么紧密。
图2 低质量精子的细胞核经SDS/EDTA处理后更容易发生解凝
3、 生成SWATH 谱图库，SWATH定量分析
胰酶消化后，从6个供体中随机选择5个高、6个低质量精子的11个样品，在数据依赖模式下运行质谱仪，生成光谱文库。该文库由389个蛋白质组成，其中包括1331个多肽和8797个光谱，整体FDR为 1%。
通过SWATH采集模式在Triple-ToF 6600上对8个捐赠者多的高/低质量精子样本进行检测，使用Perseus软件对SWATH数据进行相对定量。对数据进行log转换，通过配对的Welchs t检验，发现两组间共有26个蛋白存在显著性差异，占总蛋白的6.7%(389个中的26个)，具有显著调控的蛋白见表1。
表1 在低质量精子中，Percoll密度梯度分离后的蛋白含量明显增加。
4、 在低质量的细胞中，鱼精蛋白2和组蛋白没有变化
SWATH数据显示无论是精蛋白2还是任何组蛋白都没有显著差异。为了证实这一点，本文使用抗组蛋白H3的抗体来比较高质量和低质量的精子，SDS免疫印迹检测结果显示H3和对照αTubulin没有变化（图3A），并且SWATH数据分析组蛋白H3的丰度在两组间无显著差异（图3B）。
图3 组蛋白H3在高质量精子和低质量精子之间是一致的
5、 低质量精子中含有更丰富的蛋白质
观察表1可以发现，所有的蛋白在不同的组间存在显著差异，而在低质量精子中则更为丰富。为验证SWATH数据分析，本文从表一中选择倍数明显发生变化的拓扑异构酶 2A(TOP2A)和蛋白质二硫键异构酶A3 (PDIA3)进行免疫印迹。结果所示，PDIA3蛋白在低质量精子的细胞核内更为丰富（图4A）；但供体间差异明显，1号供体的PDIA3含量似乎低于3号供体(图4B)。但是，在所有情况下，PDIA3在低质量精子的细胞核中始终较高，这符合作为标准化表达绘制的蛋白质组学数据（图4C）)(注意，与高质量精子细胞相关的负值是由于对中位数的标准化)。
图4 PDIA3在低质量精子中含量较高
PDIA3免疫细胞化学分析显示完整精子的染色差异很大(图5A)。结果表明，该蛋白位于细胞的几个不同区域，包括多余的核膜(图5A、ii、a)、核周膜(图5A、ii、b)和残余的细胞质(图5A、ii、c)。
图5 PDIA3的免疫细胞化学分析
6、 Top 2A与低质量的精子头有关
免疫印迹分析显示，TOP2A(图6A)在低质量精子中更为丰富，这与SWATH定量数据一致(图6B)。免疫组化染色显示，TOP2A定位于残余的核膜(图7A)。多余的核膜由精子发育过程中细胞核压实后核膜的过度覆盖构成。图7A,iv显示了TOP2A与DAPI染色细胞核的接近度，表明TOP2A是精子细胞核腔室的一部分。在精子中使用抗TOP2A抗体荧光，计数统计发现在低质量精子中的TOP2A数量与在高质量精子中TOP2A数量存在显著差异（图7B）。最后本文确定不论精子来自Percoll密度梯度的哪个部分，绝大多数呈现TOP2A阳性的精子均表现出无定形的头部（图8）。
图6 来自低质量精子中TOP2A含量更高
图7 免疫荧光检测精子中的TOP2A，证明该蛋白与无定形头部相关
图8 TOP2A与无定形精子头相关
五、 文章亮点
在精子形成过程中，精子基因组被包装成接近晶体状态，核体积也减少至任何体细胞的1/7。本文通过密度梯度来分离低质量和高质量的精子，并从低/高质量精子分离细胞核进行SWATH定量分析，发现低质量精子细胞核中含有更丰富的蛋白质。经过免疫印迹和免疫细胞化学等实验验证，TOP2A与无定形的精子头高度相关，因此，在临床实践中，TOP2A可能成为男性不育的一个新的生物标志物。
解读人：卜繁宇
