笔记主要内容：1~3代测序技术，fastq文件 & FASTQC

（1）测序技术

1、一代测序技术：Sanger Sequencing

测序条件：需要有足够的量的单链DNA，即相同序列需要达到多少数量才能进行测序。测序过程：以一条链作为模板，DNA聚合酶将环境中的材料（dNTP & ddNTP），进行结合，即合成另一条链（ddNTP结合之后，DNA合成反应终止）。下图所示，SEQUENCE (END)代表对应DNA序列的最后一个碱基是什么。

二代测序python 二代测序实验详细过程_html

2、二代测序技术：Illumina Sequencing Cluster Generation

产业巨头：Illumina（e.g. NovaSeq 6000）
测序过程：对DNA序列加上接头序列 & 引物，经桥式PCR，不同的DNA序列形成不同的cluster。在反应环境中加入ATCG（荧光），摄像机对不同的光信号进行捕捉，记录对应的碱基信息，随后洗去目前碱基的荧光组分，进行下一步的DNA链合成反应。
【需要注意的技术】桥式PCR

3、三代测序技术：Single Molecule Sequencing

技术代表：PacBio & Nanopore（两者技术不同）
与NGS对比，其不需要对序列进行扩增。同时，三代测序技术的测序片段长度也远远长于二代测序技术。

（2）Fastq & FASTQC

老生常谈了，生物信息学入门必备知识：fastq & 用于检查测序文件质量的fastqc

1、FastQ文件格式
  1. Sequence ID
  2. Sequence
  3. Quality ID
  4. Quality score

图示：

二代测序python 二代测序实验详细过程_html_02

质量值表示方式：Phred quality（一般为Phred 33），其数学含义代表某一个碱基测错的概率，计算公式为二代测序python 二代测序实验详细过程_二代测序python_03

质量值从低到高：

二代测序python 二代测序实验详细过程_html_04

关于fastq文件，需要注意的是：

  • 开头几个bp，测定结果是不稳定的，因为该测序阶段机器正在预热。
  • 最后的几个bp，可能也会出现问题（测序环境问题）
2、为什么要进行质量控制？
  • 检查公司返回的测序结果，如果不行当然要求重测了~
  • 为了后续分析的准确性
3、FASTQC结果文件解读

这边当然得推荐一下，生信菜鸟团的FASTQC笔记：http://www.bio-info-trainee.com/95.html

Per Base Sequence Quality

虽然测序片段是250bp，但是经FASTQC查看过后，最终想保留下来用于后续分析的reads长度可能就缩减到了150~200bp。
下图类似一个箱线图，用于表示测序片段某一个位置的测序质量范围。

二代测序python 二代测序实验详细过程_二代测序python_05

Per Sequence Quality Distribution

碱基对应质量值的分布（主要集中在什么质量区间，比如Q20~Q30）

二代测序python 二代测序实验详细过程_ci_06

Nucleotide Content Per Position

对应的就是100bp的序列在每一个位置上的碱基占比（A，T，C，G）。如果是在全基因组水平进行测序，每一种类型的碱基其占比应在25%左右，若非上述情况（比如链特异性测序，则碱基占比会改变）

下图“Good quality”的情况，可以选择将每一条序列的前几个bp给trim掉。

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Per Sequence GC Content

此部分就是FASTQC将实际的GC content与期望的GC content进行对比，如果像下图右边一样，就代表测序可能出现了一些问题（e.g. 样品被污染）

二代测序python 二代测序实验详细过程_ci_08