"视觉蛋白质组学"是一种科学研究领域，旨在使用先进的成像和分析技术，如冷冻电子断层扫描（cryo-ET）等，以高分辨率观察和理解细胞内蛋白质及其相互作用的结构和功能。这一领域的目标是深入研究细胞内部的分子机制，以揭示生命的奥秘和生物学过程。视觉蛋白质组学的发展为科学家提供了研究细胞和生物体系更全面的工具，有望推动生物学和医学领域的进步。
冷冻电子显微镜揭示了核孔复合物的内部运作。图片来源：S. Mosalaganti et al./Science
如果有人将一个复杂引擎的微小部件递给你，并要求你解释其在更大机器中的作用，除非你是一个熟练的机械师或工程专家，否则你所能做的就是给出一个有根据的猜测。
从根本上说，这正是细胞生物学家的困境。诸如冷冻电子显微术（cryo-EM）和人工智能系统AlphaFold等方法提供了获取单个蛋白质的原子级结构的工具；最先进的分子方法可以阐明这些蛋白质在细胞中的活性位点及其功能。然而，将分子水平上蛋白质的真实互作关系进行可视化仍旧非常困难。一种称为冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的新兴工具正在帮助弥合这一差距，并提供了前所未有的机会来窥探细胞内部。
例如，2022年，英国牛津大学的结构生物学家Peijun Zhang及其同事使用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）揭示了某些细菌用来捕获和再利用温室气体甲烷的酶作用的进程[1]。研究结果显示了两种关键酶是如何通过组装成膜结构，将一种酶的产物直接输送给另一种酶，作为其底物的过程。Zhang解释说：“反应产物都集中在一个小区域，以便有效。”她补充说，这一发现只能在完整细胞的环境下进行，只有这样才能保证蛋白复合物保持天然状态。“你无法在体外做这种事情。”
其他研究人员正在应用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）来深入了解光合作用、蛋白质合成以及细胞核孔复合体（NPC）的工作原理，这些都是视觉蛋白质组学领域的一部分，该领域旨在以体外方法如冷冻电子显微术的分辨率来描述细胞内的生物分子机制。但冷冻电子断层扫描（cryo-ET）目前还远远没有达到那个阶段，cryo-ET的实验数据通常难以解释。
德国马丁斯里德马克斯·普朗克生物化学研究所的结构生物学家Wolfgang Baumeister说：“我们看到了一切，这也意味着我们有机会观察到意想不到的事情。但这也带来了一个巨大的挑战，即识别和注释我们在断层扫描中看到的所有密集的内容。”目前，研究人员仍在努力找出如何在细胞密集包装的环境中最好地识别他们感兴趣的靶标。
自20世纪30年代以来，电子显微镜一直是以原子分辨率观察生物样本的强大工具。在冷冻电子显微术（cryo-EM）中，纯化的蛋白质被快速冷冻成透明的冰，然后进行成像。通过计算从不同的角度和方向捕获这些蛋白质分子的详细图像，对该蛋白进行重建以产生3D结构，通常该分辨率足以区分单个原子。
叠加赔率（Stacking the odds）
cryo-ET所需的实验样本是冷冻的整个细胞（而不是提纯的蛋白质），通过使用专门设备“切割”样本的顶部和底部产生薄层（lamella）。这通常是通过快速扫描一个聚焦的离子束在目标位置上刮去多余的冰和生物材料来实现的。然后对这些薄层进行多个角度的成像，以记录分子内容，然后利用相关算法重建蛋白质的3D断层扫描图，随后完成进一步的处理和分析。
该技术的起源可追溯到Baumeister实验室，他的实验室在近40年前就开始研发cryo-ET。Baumeister说，要使这项技术成功应用于研究领域，需要数十年的努力。“差不多20年前，我们才真正能做我们所希望做的事情，即观察细胞的分子结构。”这些年来，电镜技术在方法学上取得了相当大的进展，包括引入了聚焦离子束切割、超灵敏电子探测器和更高质量的显微镜。
然而，这并不意味着cryo-ET变得容易。加利福尼亚大学圣迭戈分校的生物物理学家Elizabeth Villa说：“这不完全是结构生物学，也不完全是细胞生物学，它有点像两学科之间的交叉融合。”与应用于冷冻电子显微技术的纯化蛋白质样本不同，断层扫描涉及在其自然环境中寻找蛋白结构——重点是“搜索”（search）。Villa说：“cryo-ET的‘秘密’是，一个断层扫描仅覆盖了哺乳动物细胞的大约0.001%。”因此，任何单个薄层包含研究人员正在寻找的特定蛋白质或事件的机会都很小。Villa估计，这对于微生物样本来说，机会更大，cryo-ET可以覆盖大约30-50%的细菌细胞。因此，微生物学是cryo-ET研究人员的主要关注领域。
数据收集后，冷冻电子断层扫描的挑战是分析。在这里，酵母细胞的2D切片（左图;左下角的原始数据，右上角的改进对比度）通过分析工具DeePiCt转换为核糖体重建（右图）。图片来源：I. de Teresa-Trueba et al./Nature Methods
然而，像Villa这样的专家们建议，在开始之前，研究人员应该先做好功课，例如，使用其他方法了解一个蛋白质的丰度，或影响事件发生频率的因素。这尤其重要，因为cryo-ET需要数百甚至数千个感兴趣的靶标示例才能产生信息丰富的重建结构图。
即便如此，研究也很容易变成一场试探性的探险。例如，2022年，瑞士巴塞尔大学的细胞生物学家Benjamin Engel完成了一项长达数年的工作，重建了藻类Chlamydomonas用于组装和维护其纤毛（纤毛是参与运动和环境感知的毛状结构）的细胞机制[2]。Engel说：“我们只是随机地切割这些藻类细胞，试图击中纤毛底部的结构。收集这个结构花了很多年的时间。”更快的薄层生成工作流程提高该工作的效率，Zhang说，自动化流程已经将每天可制备的样本数量从5或6增加到40。尽管如此，解析一个结构可能需要数百个样本。
照亮细胞的聚光灯（Shining a cellular spotlight）
研究人员还可以使用一种称为相关光学和电子显微镜（CLEM）的技术来缩小他们需要搜索的细胞区域。借助CLEM技术，利用荧光标记特定蛋白质或细胞中事件可能发生的区域，然后在经过特殊设计的冷冻荧光显微镜下对样本进行成像，以便研究人员更好地靶向薄层。
例如，2020年，Villa及其同事使用CLEM揭示了与帕金森病相关的突变蛋白质如何干扰细胞不同部分之间基本生物分子的运输[3]。Villa说：“只有30%的细胞具有我们正在寻找的表型，如果我们只是在随机位置随机切割薄层，我们将永远找不到它。”
但与cryo-ET的情况类似，将荧光和电子显微镜数据相对应并不容易。标准荧光成像产生的分辨率远低于电子显微镜，因此产生最佳薄层仍然可能需要运气。牛津大学的结构生物学家Kay Grünewald解释说：“有时候你在电子显微镜放大倍数下的整个图像只是光学显微镜中的一个像素。”一些团队正在努力将CLEM与单分子分辨率荧光显微镜相结合，但这仍然是一项正在进行中的工作。目前，Grünewald和其他人经常使用电子密度足以用电子显微镜检测到的微小荧光珠，从而更容易对两个成像系统之间的位置进行三角测量。
冷冻电子断层扫描以及相关技术可以以惊人的细节展示细胞内部。图片来源：S. Albert et al./PNAS (CC BY 4.0)
但是，在多台仪器之间移动样本也存在问题，包括增加了污染的机会。而位于德国海德堡的欧洲分子生物学实验室的结构生物学家Julia Mahamid指出，即使是冷冻样本在制备过程中也可能会变形和移位。在这个阶段如果没有荧光成像，这些扰动可能会被忽略。
新一代集成式冷冻电子断层扫描与荧光显微镜系统（cryo-CLEM）将有望解决这些挑战。例如，中国科学院北京分院开发的ELI-TriScope平台[4]为研究人员提供了共定位电子（E）、光（L）和离子（I）束。该项目的主要研究人员之一、中国科学院生物物理研究所结构生物学家 孙飞表示，在对细胞分裂过程中影响染色体分类和分离的中心粒的研究中，该系统为他省去了许多猜测。他说：“我们的成功率从之前的约5%提高到了90%。”这是一个巨大的改进。
与此同时，由于电子显微镜缺乏类似于绿色荧光蛋白的等效物（使用遗传编码的报告基因来进行荧光标记实验），因此正在寻找不需要荧光成像即可让研究人员聚焦于靶标的标记方法。现有方案，例如，与蛋白质结合的功能性基团耦合的金属纳米颗粒，太大并且有可能会人为的聚集多个靶标。Baumeister担心这些标签可能会干扰cryo-ET揭示的纳米级细节。尽管如此，有些方法已经取得了有希望的结果。例如，Grünewald和他的同事开发了基于DNA的“折纸”（ origami）标签（可以折叠成电子致密的非对称形状），可靶向感兴趣的细胞特征[5]。尽管目前这些标签仅限于体外蛋白质，但Grünewald正在探索将它们传递到细胞内的方法。他说：“它还没有我们希望的那么通用，但对于某些问题，效果相当不错。”
梳理混乱（Combing through the chaos）
在切片、倾斜和成像完成后，cryo-ET图像会被重建成一个个的3D断层扫描图片，接下来，真正的艰苦工作开始了。科学家们必须仔细研究每个断层图，以提取他们感兴趣的细胞特征。
不幸的是，即使是高质量的原始cryo-ET数据看起来也像是未调谐的模拟电视机的纹理单色静态图。经验丰富的专业人员可以识别出脂质膜或线粒体等特征，但要找到单个蛋白质或复合物确实是一个棘手的问题。
标准方法是使用模板匹配软件，该软件利用现有的结构数据在黑色和灰色的漩涡中挑选出目标。尽管相对快速，但这种方法不够精确，Mahamid指出，即使是研究得很透彻的分子组装，如蛋白质合成核糖体，也可能被忽略。对于小型、丰度较低或无序的蛋白质来说，这个过程更不可靠，而且根据定义，需要有关靶标的先验结构知识。
更多自动化 （More automation）
基于深度学习的结构预测算法，如AlphaFold和RoseTTAFold，已经成为宝贵的工具。它们允许研究人员对知之甚少的蛋白质外观提出假设，甚至对神秘结构进行逆向工程，并可能识别形成它们的蛋白质序列。例如，2022年6月，位于德国法兰克福马克斯·普朗克生物物理学研究所的Martin Beck及其同事在对人类核孔蛋白复合体进行全面研究时使用了AlphaFold和RoseTTAFold[6]。结果模型捕捉到了多种蛋白质构象，这些构象代表了可形成核孔蛋白复合体的约1000种蛋白质中的90%，其中许多蛋白在此之前定义都不明确。背靠背 Nature 新方向 - 蛋白质结构家族图谱的“潘多拉魔盒”
深度学习还帮助研究人员以更自动化的方式注释其断层图。但是，这些工具通常也使用模板，包括由Mahamid及其同事开发的DeePiCt算法[7]。Mahamid将其描述为比早期的模板匹配改进了很多，但她补充说，“我们仍然缺少约20%的粒子”。
4月份，位于德国多特蒙德马克斯·普朗克分子生理学研究所的Stefan Raunser团队描述了一种替代方法TomoTwin，该方法可以在不需要事先了解感兴趣结构的情况下对粒子进行选择和分类[8]。根据Engel的说法，这种方法在自动生成详细的蛋白质样本图谱的目标方面还有很长的路要走。他说：“我认为我们所有人都想要的实现的是‘视觉蛋白质组学’按钮：你按下一个按钮，它就会为你提供一切。”
拥有足够高质量的粒子，cryo-ET可以生成接近cryo-EM的原子细节的结构。这通常涉及到一个被称为亚断层平均的过程，该过程使用许多3D粒子快照来产生目标外观的高置信度共识。这些重建的最终分辨率可以通过应用图像处理和精炼算法进一步增强，例如由加利福尼亚南旧金山市生物技术公司Genentech的计算生物学家Dimitry Tegunov开发的Warp和M工具。这些工具可纠正降低cryo-ET图像质量的实验异常现象。
Mahamid与包括Tegunov在内的研究人员合作，使用这些和其他工具重建了细菌核糖体与蛋白质合成抑制剂的相互作用，分辨率达到3.5埃（约为氢原子直径的三倍）[9]。这绝非易事；Mahamid需要用20000个核糖体示例来构建这个模型，而核糖体是细胞中较为丰富的复合体之一。
Baumeister说，这是一个关键的限制。“可能只有10-20%的蛋白质组适用于亚断层平均，”他说，“这不仅需要丰度，也需要样本规模。”更多的自动化和更快的样本处理可以解决前者，他说，但是在原始图像数据质量大幅提高之前，较小且无序的蛋白质可能仍然是一个挑战。
迈向视觉蛋白质组学（Towards visual proteomics）
随着cryo-ET专家不断突破极限，推动技术的发展，研究人员担心这个领域将演变成一场争夺原子分辨率的竞赛。Engel解释说：“对于我们正在解决的很多问题，我们并不需要原子级分辨率。”尽管他补充道：“但我也不会拒绝它。” 例如，Engel的大部分研究聚焦在驱动植物光合作用的内部机制上，特别是这些结构的位置以及它们的组织方式。他说，甚至相对较低的分辨率，如10-15埃，可能足以解决这些问题。
目前，cryo-ET领域最迫切需要的是数据。人工智能算法的表现取决于它们的训练集，而在图像处理和分析方面的深度学习进展需要一个庞大的带有注释图像的存储库，这些图像可以指导从复杂的细胞混合物中挑选和解释单个粒子。
此外，还需要训练有素的人员，能够使用高度专业化和昂贵的设备。Baumeister估计，开发完整的cryo-ET工作流程的成本可能超过1000万欧元（合1070万美元）。他说：“这远远超过了年轻教职工的启动经费”。事实上，当Mahamid（曾是Baumeister实验室的成员）首次寻找教职工作时，她的选择受到现有cryo-ET履历的限制。她说：“我只能申请一个地方。”
尽管如此，势头正在增强，研究人员正在寻找创新的途径来应用这一方法。其中包括Engel，他与合作者一起使用便携式快速冷冻设备，在巴塞尔的实验室中收集来自欧洲沿海地区的海洋样本进行cryo-ET分析。Engel表示，这种技术与下一代计算工具相结合，有朝一日可以使从原始样品转化为全新物种的分子清单成为可能。Engel说：“如果我们能推动分辨率的提升，并且通过生物信息学和成像的结合来识别所有的东西，我们真的可以做任何事情。” Engel说：“它为我们世界的更多探索打开了大门。”
参考文献：
[1]. Zhu, Y. et al. Nature Commun. 13, 5221 (2022).
[2]. Van den Hoek, H. et al. Science 377, 543–548 (2022).
[3]. Deniston, C. K. et al. Nature 588, 344–349 (2020).
[4]. Li, S. et al. Nature Methods 20, 276–283 (2023).
[5]. Silvester, E. et al. Cell 184, 1110–1121 (2021).
[6]. Mosalaganti, S. et al. Science 376, eabm9506 (2022).
[7]. de Teresa-Trueba, I. et al. Nature Methods 20, 284–294 (2023).
[8]. Rice, G. et al. Nature Methods 20, 871–880 (2023).
[9]. Tegunov, D. et al. Nature Methods 18, 186–193 (2021).
阅读原文内容：
https://doi.org/10.1038/d41586-023-02909-7
